RELATRIO FINAL DE ATIVIDADE DO RELATRIO FINAL DE ATIVIDADE DO BOLSISTA UFPE /CNPq/PIBIC 1. IDENTIFICAO

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    09-Nov-2018

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1RELATRIO FINAL DE ATIVIDADE DO BOLSISTA UFPE /CNPq/PIBIC1. IDENTIFICAOProjeto: Lipossomas contendo lectinas: Preparao, caracterizao fsico-qumica ebiolgicaNome do bolsista: Robson Amaro Augusto da SilvaNome do orientador: Nereide Stela Santos Magalhesrea/sub-rea do projeto: Farmcia/ FarmacotecniaLocal de execuo: Laboratrio de Imunopatologia Keiso Asami (LIKA)Nmero do projeto: 40.0782. INTRODUOLipossomas so pequenas vesculas esfricas com dimetros variando de algunsnanmetros a poucos micrometros (sempre > 25nm), constitudos principalmente porfosfolipdeos e outros componentes da membrana celular, os quais, quando em presena dagua, originam camadas moleculares duplas que, por sua vez, formam estruturas mono oupolicompartimentais (Prista et al., 1995).Lipossomas conjugados a protenas so muito utilizados como vetores de frmacos,principalmente por causa do seu potencial uso como sistema de liberao controlada dedrogas e aplicao na rea de diagnstico (Kompella e Lee, 2001; Yamazaki et al., 2000;Bendas et al., 1997). Como exemplo clssico de protenas conjugadas a lipossomas, temosos anticorpos, muito embora a tcnica de conjugao de protenas a lipossomas possa seraplicada a diversas outras protenas tais como, protena A de Staphylococcus aureus,lectinas de plantas e enzimas (New, 1990).Grandes esforos tm sido feitos para desenvolver formulaes que possuam acapacidade de manter a estabilidade das protenas e prolongar sua atividade biolgica apsa aplicao (Meyenburg et al., 2000).O termo lectina (do latim legere, pegar, escolher) foi primeiro empregado porBoyd e Shapleigh, em 1954, para descrever aglutininas grupo sangneo-especficasencontradas em sementes e outras partes de determinadas plantas. Atualmente, esse termose refere a uma classe de protenas de origem no imunolgica, largamente distribudas nanatureza podendo originar-se de plantas e bactrias que aglutinam clulas ou precipitampolissacardeos ou glicoconjugados (Liener et al., 1986) e possuindo estruturas similares oudistintas (Correia e Coelho, 1995; Tavares et al., 1996), e que reconhecem carboidratoslivres ou ligados a superfcies celulares atravs de stios de ligao nos quais ahidrofobicidade a principal fora de interao (Kennedy et al., 1995).No Brasil, mais precisamente no estado de Pernambuco, uma lectina tem sidopurificada e parcialmente caracterizada a partir de sementes de uma planta nativa doNordeste brasileiro de Cratylia mollis (feijo camaratu), que uma planta leguminosanativa da regio semi-rida de Pernambuco. Cra possui forte ligao para tecidos humanoscom cncer maligno, particularmente para aqueles de glndulas mamrias, tero e crebro.A aplicao das lectinas pode ser ampla e variada, como na avaliao de superfciescelulares, tipagem sangnea (Mo et al., 2000), estimulao mitognica (Nomura et al.,1998), deteco de alteraes durante transformaes celulares (Kabir, 1998), marcadoresde tecidos tumorais (Beltro et al., 1998), entre muitos outros.2O sucesso da liberao destas molculas depender do Sistema de LiberaoControlada que oferecer uma boa proteo assim como uma melhor penetrao celular(Abu-Dahab et al., 2001). Lipossomas conjugados a protenas so muito utilizados comovetores de frmacos, principalmente por causa do seu potencial uso como sistema deliberao controlada de drogas e aplicao na rea de diagnstico (Kompella e Lee, 2001;Yamazaki et al., 2000; Bendas et al., 1997).Recentemente a administrao intraperitoneal tem demonstrado prolongar acirculao sangnea de lipossomas causada pela menor absoro dos lipossomas pelacavidade abdominal. Alm do mais, a depurao lenta de lipossomas a partir da cavidadeabdominal prolonga o contato das clulas tumorais com o material encapsulado (Sadzuka etal., 2002). Este estudo tem como finalidade uma investigao da eficcia da lectina deCratylia mollis encapsulada em lipossomas, avaliando sua liberao in vitro e a atividade invivo. 3. MATERIAIS E MTODOS3.1 Materiais Estearilamina Colesterol Clorofrmio Metanol Fosfatidilcolina de soja (Epikuron 200) Formol Tampo fosfato Trealose Lectina de Cratylia mollis Hidrxido de sdio Reagentes de Grau Analtico foram obtidos da Merck. A Lectina de Cratylia mollis foipurificada e gentilmente cedida pelo laboratrio de glicoprotenas da UFPE.3.2 Metodologia3.2.1 Lipossomas - FormulaoInicialmente os constituintes lipdicos, fosfatidilcolina de soja, colesterol,estearilamina (7:2:1) so dissolvidos em soluo de clorofrmio/metanol 3:1 (v/v) sobagitao magntica. Aps 15min de agitao, a soluo orgnica foi submetida aevaporao sob presso reduzida por 25 min a 1C a 120 rpm para remoo do solvente eobteno do filme lipdico seco. A adio de uma soluo tampo fosfato pH 7.4 contendo0.1% de trealose e Cra (700g/ml) ao filme lipdico promovendo sua hidratao. Esseprocedimento executado sob agitao magntica por 40min. As vesculas unilamelarespequenas (SUV) so obtidas por sonicao a 200W com 40 ciclos/s durante 250s.Finalmente a suspenso de lipossomas liofilizada usando trealose como crioprotetorutilizando liofilizador (USA) a 200bar durante 16 horas.33.2.2 Caracterizao fsico-qumica de Cra-lipossomasA anlise fsico-qumica de lipossomas foi realizada imediatamente aps apreparao e ento a intervalos de tempos regulares. Alguns parmetros como aspectosmacroscpicos e microscpicos, exames morfolgicos, variaes no pH e taxa deencapsulao foram analisados. A distribuio do tamanho das vesculas foi determinadapor nanosizer NMD4 (Coulter, USA).3.2.3 Avaliao da estabilidade dos lipossomasA formulao de lipossomas foi submetida a testes de estabilidade acelerada e alongo prazo visando estabelecer a durabilidade da formulao. Os lipossomas foramsubmetidos a uma centrifugao de 3500 rpm/min por 1h, estresse mecnico (150 strokes/min por 48h) e ciclos congelamento descongelamento (16h a18C e 8h a 25C). Aspropriedades fsico-qumicas das formulaes foram avaliadas a 7, 15, 30, 45, 60, 120 diasou at a perda da estabilidade.3.2.4 Atividade hemaglutinanteA avaliao da atividade hemaglutinante (AH) de Cra foi realizada com eritrcitosde coelhos tratados com glutaraldedo (Correia et al., 1995).Amostras da lectinas (50l) foram diludas em NaCl 0.15M por duas vezes emplacas de titulao. Uma suspenso de eritrcitos de coelho (2.5% v/v em NaCl 0.15M,50l) previamente tratados com glutaraldedo foram adicionados e o ttulo foi lido aps 45min. A AH definida como o inverso da ltima diluio que apresentou hemaglutinao.3.2.5 Cintica de liberao in vitroO experimento da cintica in vitro foi realizado da seguinte forma: 10ml delipossomas contendo Cra foram diretamente colocados em 50ml de uma soluo tampofosfato pH 7.4 (Santos Magalhes et al., 1998). Alquotas de 5ml foram coletados aintervalos de tempos regulares (5, 10, 15, 30, 45, 60, 120, 240 e 360 minutos) e asconcentraes de Cra foram determinadas pelo mtodo de Peterson (1977).3.2.6 Atividade antitumoral de lipossomas contendo CraOs estudos foram realizados em camundongos visando avaliar a atividadeantitumoral de lipossomas contendo Cra contra clulas tumorais de Sarcoma 180 (5.5.106clulas). As clulas foram inoculadas subcutaneamente em camundongos Albinos Suosmachos (peso 20-25g, 35-49 dias de idade). O tratamento dos animais comeou 24h aps ainoculao sendo realizada com Cra em soluo e Cra encapsulada em lipossomas comdose diria de 7mg/Kg. As injees foram administradas intraperitonealmente durante 8dias. Aps uma semana de tratamento os animais foram sacrificados e os pesos dos tumoresforam mensurados. Ento a inibio tumoral foi determinada a partir da pesagem dostumores relacionando o grupo de animais tratados e o grupo de animais no tratados(controle).3.2.7 Anlise histopatolgicaOs rgos dos animais (tumor, fgado, rins e bao) foram submetidos ao examehistopatolgico. Os tecidos foram preservados em soluo de tampo formalina 10% at a4incluso em parafina. Cortes (4m) de amostras dos tecidos foram preparados e fixadoscom hematoxilina e eosina, e examinados por microscopia ptica (Olympus BH-2 Japo).4. RESULTADOS E DISCUSSO4.1 Caracterstica fsico-qumica de lipossomas contendo CraO estudo fsico-qumico da estabilidade foi realizado com vrias formulaes queincluam lipossomas com carga negativa, lipossomas com carga positiva e lipossomasneutros, at a obteno da melhor estabilidade.Dentre as formulaes testadas a que melhor estabilidade foi submetida a testes alongo prazo. Os principais resultados esto na tabela abaixo:Tabela 1 Otimizao da formulao de Cra-lipossomasConstituintesFormulaes SoluoTampo(ml)pH Fosfolipdeos(g)Colesterol(g)Estearilamina(g)Cra (g)LC1 Citrato/ 10 6.65 0.196 0.028 0.010 --LC2 Citrato/ 10 5.40 0.196 0.028 0.010 --LC3 Citrato/ 10 5.41 0.392 0.056 0.020 20LC4 Fosfato/ 10 6.20 0.196 0.028 0.010 --LC5 Fosfato/ 10 7.40 0.196 0.028 0.010 700LC6 Fosfato/ 10 6.81 0.196 0.028 0.010 20LC7 Citrato/ 5 5.41 0.098 0.014 0.005 250LC8 Citrato/ 10 5.40 0.196 0.028 0.010 300LC9 Citrato/ 10 5.40 0.196 0.028 0.010 500A melhor formulao foi LC que se apresentou bastante estvel quando submetidaao estresse, centrifugao, ciclos de congelamento descongelamento. Em testes alongoprazo ocorreu a sua estabilidade at o prazo de 120 dias.A Atividade Hemaglutinante no foi modificada aps submeter as preparaes delipossomas as condies de testes de estabilidade. Os dados indicam a integridade dasprotenas encapsuladas pode ser mantida durante o processo de formulao.Efeitos do ultra-som e estresse mecnico na Atividade Hemaglutinante da CraFigura 1 Atividade hemaglutinanteUltra-som(contnuo, potncia de 200w)Estresse Mecnico (150strokes/min)Tempo 100 (s) 250 (s) 500 (s) 24 (h) 48 (h)AH (Log) 3.01 2.71 2.71 3.01 2.7154.2 Cintica de liberao in vitroO perfil da cintica foi encaminhado em intervalos de 5 a 60 minutos sem arealizao completa da liberao. Inicialmente a cintica foi observada nos intervalos564.4 Anlise HistopatolgicaNos grupos tratados com lectina livre observou-se um infiltrado inflamatriolinfocitrio no fgado. Analisando o Sarcoma 180 observo-se a ocorrncia de fibrose enecrose, alm de uma aparente diminuio do nmero de clulas. Para a lectinaencapsulada no foi observada a presena de infiltrados inflamatrios no fgado e nos rins,apresentando em relao ao Sarcoma 180 uma diminuio da densidade de clulas tumoraise aparente diminuio das reas necrosadas.Figura 4 Aspecto morfolgico de grupos tratados e no-tratados com Cra livre e Cra-lipossomas, proliferao normal para o controle (a), reas de necrose para Cra livre (b) ediminuio da densidade celular para Cra-lipossomas (c).5. CONCLUSOEnsaios preliminares demonstraram que Cra manteve sua estabilidade sob ascondies agressivas da preparao dos Lipossomas (ultra-som e solventes orgnicos).Lipossomas contendo Cra apresentaram uma forma esfrica e mantiveram sua estabilidadepor mais de 60 dias quando estocados a 4C. A lectina Cra mostrou-se bastante estvelquando em contato com agentes desnaturantes. Na cintica in vitro permitiu estimar a taxade liberao de Cra a partir de lipossomas. A liberao dos lipossomas foi substancialmenterpida, considerando que mais de 50% do contedo de Cra foi liberado durante osprimeiros 25 min do processo de liberao na cintica. Esse sistema mostra uma difusocontrolada da liberao de protena que completada em poucas horas. A Cra encapsuladamostrou uma atividade antitumoral 50%maior em relao a Cra livre. A liberaocontrolada da Cra livre mostrou em exames histopatolgicos uma menor toxicidade quandocomparada com a administrao de Cra livre. Uma maior atividade antitumoral obtidaquando se utiliza Cra encapsulada. Os resultados dessa pesquisa apontam Cra-lipossomascomo uma nova possibilidade teraputica, devido a sua estabilidade e atividade antitumoral.6. MATRIA ENCAMINHADA PARA PUBLICAOTtulo: Antitumoral activity of Cratylia mollis lectin encapsulated into liposomesAutores: Andrade, C. A. S., Correia, M. T. S., Coelho, L. C. B. B., Nascimento, S. C.,Silva, R. A. A., Santos-Magalhes, N. S.O artigo ser submetido a revista International Journal of Pharmaceutics.AN ANa b c77. BIBLIOGRAFIAABU-DAHAB, R., SCHAFER, U. F. AND LEHR, C.-M. Lectin-functionalized liposomes for pulmonarydrug delivery: effect of nebulization on stability and bioadhesion. Eur. J. Pharm. Sci., 14, 37-46, 2001.BELTRO, E. I. C., CORREIA, M. T. S., FIGUEIREDOSILVA, J. AND COELHO, L. C. B. B. Bindingevaluation of isoform 1 from Cratylia mollis lectin to mamary human tissues. Applied Biochem. Biotechnol.,74, 12534, 1998.BENDAS, G., VOGEL, J., BAKOWSKI, U., KRAUSE, A., MLLER, J. AND ROTHE, U. A liposome-based model system for the simulation of lectin-induced cell adhesion. Biochem. Biophys. Acta, 1325, 297-308, 1997.CORREIA, M. T. S. AND COELHO, L. C. B. B. Purificaton of a glucose/mannose specific lectin, isoform 1,from seeds of Cratylia mollis Mart. (camaratu bean). Applied Biochem. Biotechnol., 55, 261-73, 1995.KABIR, S. Jacalin: a jackfruit (Artocarpus heterophyllus) seed derived lectin of versatile applications inimmunobiological research. J. Immunol. Methods, 212, 193211, 1998.KENNEDY, J. F., PAIVA, P. M. G., CORREIA, M. T. S., CAVALCANTI, M. S. M. AND COELHO, L. C.B. B. Lectins, versatile proteins of recognition: a review. Carbohydrate Poly., 26, 21930, 1995.KOMPELLA, U. B. AND LEE, V. H. L. Delivery systems for penetration enhancement of peptide andprotein drugs: design considerations. Adv. Drug Deliv. Rev., 46, 211245, 2001.LIENER, I.E.; SHARON, N.; GOLDSTEIN, I. J. PREFACE IN: I. E. LIENER, N. SHARON AND I. J.GOLDSTEIN (Eds.), The lectins: Properties, functions and applications in biology and medicine. AcademicPress, Orlando, FL, pp. xi-vv, 1986.MEYENBURG, S., LILIE, H., PANZNER, S. AND RUDOLPH, R. Fibrin encapsulated liposomes as proteindelivery system studies on the in vitro release behavior. J. Control. Rel., 69, 159168, 2000.MO, H., WINTER, H. C. AND GOLDESTEIN, I. J. Purification and characterization of a Neu5Ac 26 Gal-14 Glc/GlcNacspecific lectin from the fruiting body of the polypore mush room Polyporus squamosus. J.Biol. Chem., 275, 1062329, 2000.NEW, R. R. C. Liposomes: a practical approach. Oxford: IRL Press, 1990.NOMURA, K., ASHIDA, H., UEMURA, N., KUSHIBE, S., OZAKI, T. AND YOSHIDA, M. Purificationand characterization of a mannose/glucosespecific lectin from Castanea crenata. Phytochem., 49, 66773,1998.PRISTA, L. N., ALVES, A. C. AND MORGADO, R. Tecnologia Farmacutica, 4a ed., 3, 20642083, 1995.TAVARES, G. A., CARACELLI, I., BURGER, R. CORREIA, M. T. S. COELHO, L. C. B. B. AND OLIVA,G. Crystallization and preliminary x-ray studies on the lectin from the seeds of Cratylia mollis. Acta Crystal.,52, 1046, 1996.YAMAZAKI, N., KOJIMA, S. BOVIN, N. V., ANDR, S., GABIUS, S. AND GABIUS, H. J. Endogenous8lectins as targets for drug delivery. Adv. Drug Deliv. Rev., 43, 225244, 2000.Sadzuka, Y., Hirama, R., Sonobe, T. 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APOIO O projeto teve financiamento do PIBIC-CNPq, BNB e CAPES-COFECUB 269/99.11.AGRADECIMENTOSA Deus por permitir a realizao deste trabalho. professora Dra Nereide que me deu a oportunidade de participar desta brilhantepesquisa.A Csar por sua pacincia e boa vontade no esclarecimento de minhas dvidas. professora Dra Luana por ceder a lectina com a qual trabalho.Aos rgos financiadores por patrocinar este estudo.s minhas amigas Dayse, Elaine, Simone por estarem sempre presentes oferecendoa ajuda que precisava. professora Dra Silene e a Noemia pelo fornecimento das clulas para oexperimento.A todos os outros colegas de trabalho e amigos de turma que de uma forma diretaou indireta contriburam para a realizao deste trabalho.9UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCOCENTRO DE CINCIAS BIOLGICASDEPARTAMENTO DE BIOQUMICALIPOSSOMAS CONTENDO LECTINAS:PREPARAO, CARACTERIZAO FSICO-QUMICA E BIOLGICARELATRIO FINALOrientadora: Prof. Dr. Nereide Stela Santos MagalhesAluno: Robson Amaro Augusto da SilvaRecife2002

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