Manual Tcnico de Diagnstico Laboratorial de ? 5 Patogenia e Fatores de Virulncia 12 6 Principais

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    18-Sep-2018

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  • Manual Tcnico de Diagnstico Laboratorial de

    Campylobacter

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    MINISTRIO DA SADE

    Disque Sade

    0800.61.1997

    Biblioteca Virtual em Sade do Ministrio da Sade

    www.saude.gov.br/bvs

    Secretaria de Vigilncia em Sade do Ministrio da Sade

    www.saude.gov.br/svs

    Braslia DF2011

    Ministrio daSade

    Secretaria deVigilncia em Sade

  • Manual Tcnico de Diagnstico Laboratorial de

    Campylobacter

    MINISTRIO DA SADE

    Gnero Campylobacter: Diagnstico Laboratorial Clssico e Molecular

    Braslia DF2011

    Secretaria de Vigilncia em SadeDepartamento de Apoio Gesto de Vigilncia em Sade

    Srie A. Normas e Manuais Tcnicos

  • 2011 Ministrio da Sade.Todos os direitos reservados. permitida a reproduo parcial ou total desta obra, desde que citada a fonte e que no seja para venda ou qualquer fim comercial. A responsabilidade pelos direitos autorais de textos e imagens dessa obra da rea tcnica. A coleo institucional do Ministrio da Sade pode ser acessada, na ntegra, na Biblioteca Virtual em Sade do Ministrio da Sade: http://www.saude.gov.br/bvs

    Srie A. Normas e Manuais Tcnicos

    Tiragem: 1 edio 2011 1.000 exemplares

    Elaborao, distribuio e informaes:

    MINISTRIO DA SADE Secretaria de Vigilncia em SadeDepartamento de Vigilncia EpidemiolgicaCoordenao-Geral de Laboratrios de Sade Pblica Setor Comercial Sul, Quadra 4, Bloco A, Edifcio Principal, 3 andarCEP: 70304-000, Braslia DFE-mail: svs@saude.gov.brHome page: www.saude.gov.br/svs

    Coordenao

    Lcia Helena Berto CGLAB/SVS/MS

    Equipe de elaborao

    Esta publicao foi elaborada por um grupo de profssionais pesquisadores, tcnicos de bancada do Laboratrio de Referncia Nacional de Enteroinfeces Bacterianas do Instituto Oswaldo Cruz IOC/Fundao Oswaldo Cruz Fiocruz/RJ e do Instituto Adolfo Lutz IAL/SP.

    Equipe de reviso tcnica:

    Dalia dos Prazeres RodriguesMiyoko Jakabi

    Equipe de elaborao:

    Grace Nazareth Diogo Theophilo1 Miyoko Jakabi2

    Harumi Sakuma2

    Ruth E. G. Rowlands2

    Jacqueline T. M. Peresi2

    Yara Solange K. Fonseca2

    Eliane Moura Falavina dos Reis1 Norma dos Santos Lzaro1 Renata Garcia Costa1

    Dalia dos Prazeres Rodrigues1

    1Laboratrio de Referncia Nacional de Enteroinfeces Bacterianas/IOC/Fiocruz2Instituto Adolfo Lutz

    Produo editorial:

    Capa: NJOBS Comunicao (Eduardo Grisoni) Projeto grfico: NJOBS Comunicao (Eduardo Grisoni) Diagramao: NJOBS Comunicao (Marlia Assis) Reviso: NJOBS Comunicao (Beth Nardelli e Clcia Silveira Rodrigues) Normalizao: NJOBS Comunicao (Beth Nardelli e Clcia Silveira Rodrigues) e Editora MS (Mrcia Cristina Tomaz de Aquino)

    Impresso no Brasil / Printed in Brazil

    Ficha Catalogrfica______________________________________________________________________________________________________________________

    Brasil. Ministrio da Sade. Secretaria de Vigilncia em Sade.Manual tcnico de diagnstico laboratorial de Campylobacter: gnero Campylobacter: diagnstico laboratorial clssico e mo-

    lecular / Ministrio da Sade. Secretaria de Vigilncia em Sade, Fundao Oswaldo Cruz, Laboratrio de Referncia Nacional de Enteroinfeces Bacterianas, Instituto Adolfo Lutz. Braslia : Ministrio da Sade, 2011.

    40 p. : il. (Srie A. Normas e Manuais Tcnicos)

    ISBN 978-85-334-1793-9

    1. Anlise bacteriolgica. 2. Diagnstico. 3. Intoxicao alimentar. I. Fundao Oswaldo Cruz. II. Laboratrio de Referncia Na-cional de Enteroinfeces Bacterianas (Brasil). III. Instituto Adolfo Lutz. IV. Ttulo. V. Srie.

    CDU 616-074:613.2.099______________________________________________________________________________________________________________________

    Catalogao na fonte Coordenao-Geral de Documentao e Informao Editora MS OS 2011/0094

    Ttulos para indexao:

    Em ingls: Campylobacter technical manual of laboratory diagnosis: Campylobacter Genre: classical and molecular diagnostics laboratory.Em espanhol: Manual Tcnico para el diagnstico de laboratorio de Campylobacter: Gnero Campylobacter: laboratorio de diagns-tico clsico y molecular.

  • 3

    1 Introduo 5

    2 Histrico 6

    3 Caractersticas Gerais 9

    4 Caractersticas Epidemiolgicas 10

    5 Patogenia e Fatores de Virulncia 12

    6 Principais Espcies Associadas s Infeces Humanas 15

    7 Os Alimentos como Fonte de Infeco 17

    8 Diagnstico Laboratorial 19

    9 Figuras 35

    Referncias 37

    Sumrio

  • 5

    Introduo1

    Embora vrias espcies de Campylobacter sejam ubiquitrias, algumas como Campylobacter jejuni, C. coli e C. lari so isoladas frequentemente a partir de casos de gastrenterite humana, sendo C. jejuni a principal espcie associada s Doenas de Transmisso Alimentar DTA. Estudos reportam o isolamento do microrganismo no trato gastrintestinal de diversos animais, o que pode contribuir para a contaminao de alimentos de origem animal, representando um risco potencial para a sade pblica.

  • 6

    O gnero Campylobacter foi inicialmente descrito em 1886 por Theodor Escherich que identificou uma bactria com forma helicoidal, isolada de fezes diarreicas de neonatos assim como de felinos. Foram feitas diversas tentativas, sem sucesso, para o crescimento deste micror- ganismo em meios slidos e somente em 1913 McFaydean e Stockman obtiveram a primeira cultura pura do que foi chamado vibrio e que atualmente conhecido como Campylobacter fetus, isolada do tero de uma ovelha (KIST, 1985). Em 1919, Smith e Taylor propuseram o nome Vibrio fetus para os organismos isolados de abortos em bovinos (THEOBALD, et al.; 1920). Microrganismos muito semelhantes foram posteriormente descritos como V. jejuni e V. coli, isolados do jejuno de gado e sunos, respectivamente (JONES, 1931; DOYLE, 1944).

    Um importante marco no estudo do gnero Campylobacter foi a pesquisa realizada por Elizabeth King que analisou sistematicamente amostras de Vibrio fetus isoladas de pacientes com septicemia e meningites, na qual pde fazer uma discriminao entre o V. fetus e as esp-cies termotolerantes V. jejuni e V. coli, ainda que ela tenha conservado o nome provisrio de related vibrios para os dois ltimos (KING, 1957).

    Estudos taxonmicos na dcada de 1960 culminaram na criao do gnero Campylobacter (1963), o qual era formado por vibrios microaerbicos que no possuam semelhana ao Vibrio cholerae. Dessa forma, Vibrio fetus foi denominado Campylobacter fetus assim como os related vibrios foram classificados como Campylobacter jejuni e Campylobacter coli (VRON; CHATERLAIN, 1973). Desde ento, essa classificao tem sido revista especialmente em fun-o da diversidade ecolgica, da importncia clnica e como resultado da aplicao de novos mtodos taxonmicos.

    Nas ltimas dcadas, o reconhecimento de certas espcies do gnero Campylobacter como patgenos humanos tem fortificado a importncia deste gnero tambm na me-dicina veterinria. Algumas espcies como o C. jejuni, o C. coli e o C. fetus subsp. fetus tm sido consideradas importantes zoonoses, as quais resultaram em estudos dirigidos para a taxonomia, epidemiologia, biologia molecular e patogenia. Estudos recentes em modelos animais tm ajudado a elucidar mecanismos patognicos desses organismos, especialmente quanto aos fatores de virulncia.

    Histrico2

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    A descoberta de novos campilos ou campilo-like-organisms CLO relacionados sade dos hospedeiros e aplicao de novas tcnicas moleculares tem permitido a reclassificao das espcies.

    Uma completa reviso da taxonomia, da nomenclatura do gnero Campylobacter e das bactrias relacionadas foi proposta por Vandamme e colaboradores (VANDAMME et al., 1991). A posio filogentica do gnero foi determinada pela hibridizao DNA-rRNA e pelo cruzamento de dados genticos e fenotpicos, o que forneceu a base da estrutura taxonmica utilizada na atualidade.

    A famlia Campylobacteraceae inclui, de acordo Euzby (2011), 32 espcies, 13 subespcies no gnero Campylobacter, nove no gnero Arcobacter, sete no gnero Sulfurospirillum e uma espcie no gnero Dehalospirillum:

    Campylobacter avium Campylobacter butzleri Campylobacter canadensis Campylobacter cinaedi Campylobacter coli Campylobacter concisus Campylobacter cryaerophilus Campylobacter cuniculorum Campylobacter curvus Campylobacter fennelliae Campylobacter fetus - Campylobacter fetus subsp. fetus e Campylobacter fetus

    subsp. venerealis Campylobacter gracilis Campylobacter helveticus Campylobacter hominis Campylobacter hyoilei Campylobacter hyointestinalis Campylobacter hyointestinalis subsp. hyointestinalis

    e Campylobacter hyointestinalis subsp. lawsonii Campylobacter insulaenigrae Campylobacter jejuni Campylobacter jejuni subsp. doylei e Campylobacter jejuni

    subsp. jejuni Campylobacter lanienae Campylobacter lari Campylobacter lari subsp. concheus e Campylobacter lari

    subsp. lari

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    Campylobacter mucosalis Campylobacter mustelae Campylobacter nitrofigilis Campylobacter peloridis Campylobacter pylori Campylobacter pylori subsp. mustelae e Campylobacter

    pylori subsp. pylori Campylobacter rectus Campylobacter showae Campylobacter sputorum Campylobacter sputorum subsp. bubulus, Campylobacter

    sputorum subsp. mucosalis e Campylobacter sputorum subsp. sputorum Campylobacter subantarcticus Campylobacter upsaliensis Campylobacter ureolyticus Campylobacter volucris

  • 9

    3 Caractersticas Gerais

    Entre as principais caractersticas do gnero destaca-se a forma de bacilos curvos, espi-ralados, muito finos e compridos (0,2 nm a 0,5 nm de largura e 0,5 e 5nm de comprimento). So Gram-negativos e mveis por um nico flagelo polar que apresenta de duas a trs vezes o comprimento da clula. O flagelo responsvel pelo seu movimento caracterstico em forma de saca-rolha ou vaivm. Em culturas jovens possvel a observao da morfologia semelhante asa de gaivota. No formam esporos, mas em culturas envelhecidas adquirem uma morfologia cocoide correspondente a formas no cultivveis. So quimiorganotrficos e no fermentam nem oxidam acares, obtendo energia a partir de aminocidos ou de componentes inter-medirios do ciclo do cido tricarboxlico.

    A grande maioria das espcies positiva para a enzima citocromo-oxidase e redutoras de nitrato. As espcies C. coli e C. lari so muito semelhantes, sendo diferenciadas por testes bio-qumicos: enquanto a espcie C. lari no capaz de hidrolisar o indoxilacetato, mas cresce em presena de 30 g de cido nalidxico, a espcie C. coli apresenta resultado inverso para estas reaes. Campylobacter jejuni subespcie doylei diferencia-se do C. jejuni subespcie jejuni por no ser capaz de reduzir nitrato a nitrito e crescer a 42C.

    A caracterstica mais marcante do gnero Campylobacter a microaerofilia, requerendo baixa tenso de oxignio para sua multiplicao. O crescimento inibido quando a concen-trao de O2 menor que 3% e maior que 15%, sendo a concentrao ideal de 5%. Alm dis-so, so tambm capnoflicos, ou seja, requerem cerca de 10% de CO2 para sua multiplicao (DOYLE; JONES, 1992).

    As espcies C. jejuni, C. coli e C. lari so denominadas de campilobacteres termoflicos, visto que crescem em uma faixa bastante estreita de temperatura, que varia entre 30C e 47C, com um timo de 42C (PARK, 2002).

    Esses microrganismos so altamente sensveis ao sal, sendo esta sensibilidade varivel em funo da temperatura. Assim, no se multiplicam em meios contendo 2% de NaCl quando mantidos a 30C ou a 35C. temperatura de 4C so sensveis em meios contendo 1% de NaCl. So tambm bastante sensveis ao pH cido, crescendo na faixa de pH entre 5,5 - 8,0, com valor timo prximo do neutro (6,5-7,5) e desidratao.

  • 10

    A campilobacteriose uma zoonose de distribuio mundial. As espcies de Campylobacter so organismos associados a animais de sangue quente, sendo comensais do trato gastrintestinal de bovinos, sunos, ovinos, felinos, ces, roedores silvestres e domsticos, aves domsticas e pssaros. Foi demonstrado que um grande percentual dos animais de corte possui esse mi-crorganismo nas fezes.As aves constituem o principal reservatrio de C. jejuni, sendo possvel encontr-lo em fezes e carcaas de aves recm-abatidas. As aves so portadoras naturais de Campylobacter, no entanto, no apresentam sinais clnicos da enfermidade. O suno o princi-pal portador de C. coli, podendo ter C. jejuni como comensal habitual. Muitos casos de enterite humana esto associados ao consumo de gua e/ou alimentos de origem animal, contaminados ou resultantes do contato com animais.

    Em pases desenvolvidos, a diarreia por Campylobacter mais frequente nos meses quentes, em que so afetados todos os grupos tnicos de ambos os sexos, sendo a carne de ave mal cozida o principal veculo. Por outro lado, a maioria dos casos da enfermidade em pases em desenvolvimento parece estar associada faixa etria correspondente s crianas pequenas. As espcies C. jejuni e C. coli so agentes causais importantes de diarreias agudas de viajantes que visitam regies em desenvolvimento.

    Clinicamente, o gnero Campylobacter tem sido reconhecido como agente de enterocolite humana transmitida por alimentos em diversas partes do mundo. Duas espcies deste gne-ro, C. jejuni e C. coli, so isoladas na maioria dos casos de infeces por Campylobacter com propores diversas em cada pas. Nos Estados Unidos, acredita-se que seja mais frequente que Salmonella e Shigella juntas. Muitas investigaes clnicas e epidemiolgicas tm estabelecido que C. jejuni uma das causas mais comuns de enterite bacteriana espordica nesse pas, al-canando cerca de 2,4 milhes de casos anualmente, segundo o Centers for Disease Control and Prevention CDC. Os casos estimados de campilobacteriose na Inglaterra e nos Estados Unidos so semelhantes frequncia estimada de salmonelose humana nesses pases.

    4 Caractersticas Epidemiolgicas

  • Manual Tcnico de Diagnstico Laboratorial de Campylobacter

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    No Brasil, tem-se demonstrado que C. jejuni tambm um importante agente da gastrenter-ite aguda e crnica, afetando principalmente crianas. Nos pases em desenvolvimento, a en-terocolite endmica e a frequncia de casos assintomticos elevada. Os quadros sintomticos so mais comuns na infncia e no incio da adolescncia, decrescendo com a idade.

    As infeces por Campylobacter so usualmente espordicas, ocorrendo nos meses de vero e no incio do outono, causadas pela ingesto de alimentos cozidos e manipulados inapropriadamente, com maior incidncia relacionada ao consumo de frangos. A incidncia de infeco segue uma distribuio bimodal, com elevado ndice em bebs e crianas jovens, seguida de um segundo pico de adultos entre 20 e 40 anos. Os surtos normalmente acontecem nos meses de primavera e outono e nos ltimos anos estes tm sido associados ingesto de gua e alimentos contaminados.

  • 12

    Campilobacterioses so infeces agudas causadas por algumas espcies do gnero Campylobacter que acometem homens e animais, podendo resultar em doenas diarreicas de severidade varivel. A transmisso das infeces dos animais ao homem tem sido conhecida para as espcies C. jejuni, C. coli, C. lari e C. upsaliensis. A espcie C. fetus subespcie venerealis causa aborto enzotico em gado bovino, enquanto o C. fetus subespcie fetus causa a mesma doena em ovinos, ocasionalmente em sunos e, esporadicamente, em bovinos.

    O microrganismo adquirido pela ingesto de alimentos contaminados ou por contato com fezes de animais infectados. A espcie C. jejuni sensvel ao pH gstrico, devendo ser ingerido um inculo de 104 para que haja infeco, entretanto, em alguns casos, doses da ordem de 500 microrganismos so capazes de causar infeco (ROBINSON, 1981; BLACK et al., 1988).

    A espcie C. upsaliensis raramente isolada de diarreia, entretanto, causa bacteremia em pacientes imunocomprometidos. mais resistente ao poder bactericida do soro que as outras espcies termotolerantes. A fonte de infeco ainda no est bem estabelecida, embora ani-mais, em especial os ces, e alimentos como leite no pasteurizado e seus derivados tenham sido descritos como veculos dessa bactria. semelhana de outros patgenos entricos, a transmisso fecal-oral e de pessoa a pessoa so importantes vias de transmisso.

    Embora os microrganismos no se multipliquem temperatura ambiente, uma pequena dose infecciosa (500 clulas) pode facilmente causar contaminao cruzada entre carnes sem cozimento e processadas, sendo esta uma provvel causa para o fato da campilobacteriose ser mais frequente que a salmonelose em muitos pases.

    Os sintomas de infeco por Campylobacter incluem dor abdominal aguda, diarreia (que pode ser aquosa ou conter sangue), nusea, dor de cabea, dor muscular e febre. A diarreia se inicia geralmente aps 24 horas do incio dos sintomas. A infeco por Campylobacter depende dos fatores do hospedeiro e do patgeno, sendo considerada uma doena autolimitante com durao de um a sete dias, afetando os intestinos grosso e delgado. O microrganismo excre-tado nas fezes durante vrias semanas aps terem cessado os sintomas.

    5 Patogenia e Fatores de Virulncia

  • Manual Tcnico de Diagnstico Laboratorial de Campylobacter

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    A enfermidade varia desde uma forma branda de curta durao a um quadro mais severo e prolongado com caractersticas semelhantes shigelose ou salmonelose. Algumas vezes a in-feco pode mimetizar um quadro de apendicite aguda e resultar em cirurgia desnecessria. Mortes causadas pela infeco com C. jejuni so raras, mas quando ocorrem atingem principalmente crianas, idosos ou pacientes portadores de doenas de base (TAUXE, 1992).

    Em neonatos, a diarreia pode apresentar-se sanguinolenta e sem nenhum outro sintoma. Os neo-natos tambm podem desenvolver febre severa e persistente, necessitando diferenciar de febre tifoide.

    Pacientes imunocomprometidos podem evoluir para o quadro de colicistite aguda, pancre-atite, cistite, artrite reativa e outras complicaes como sndrome hemoltico-urmica SHU, nefrite intersticial, hepatite e sndrome de Guillain-Barr GBS. Atualmente, Campylobacter conhecido como o principal microrganismo associado GBS, que um distrbio autoimune do sistema nervoso perifrico (fraqueza muscular normalmente simtrica e ascendente) e que pode ser confundido com botulismo.

    Infeces extraintestinais podem ocorrer em pacientes com o Vrus da Imunodeficincia Humana HIV positivos e imunocomprometidos, podendo causar bacteremia, bursite, artrite, infeces no trato urinrio, endocardite, peritonite, aborto e septicemia neonatal.

    O tratamento com antibiticos recomendado somente para as formas mais severas, sendo dispensado nos casos brandos. As espcies C. jejuni e C. coli so sensveis a uma variedade de agentes antimicrobianos, inclusive macroldeos, fluoroquinolonas, aminoglicosdeos, cloran-fenicol e tetraciclina. A eritromicina tem sido a droga de escolha para o tratamento de C. jejuni nas infeces do trato gastrointestinal e a ciprofloxacina uma boa droga alternativa. A terapia inicial das infeces por Campylobacter com eritromicina ou ciprofloxacina efetiva na elimi-nao do organismo pelas fezes e pode tambm reduzir a durao dos sintomas associados infeco (BLASER, 1995).

    C. jejuni geralmente susceptvel a eritromicina com taxas de resistncia menores que 5%. Contudo, em C. coli esse percentual varivel e alguns estudos relatam resistncia de mais de 80% de algumas cepas. Embora a ciprofloxacina seja efetiva no tratamento de infeces por Campylobacter, a resistncia a fluoroquinolonas durante o tratamento tem sido documentada. Alguns estudos in vitro sugerem que o aumento da resistncia a essa classe de antimicrobianos est associado ao uso de antibiticos em aves, o que acarretaria diminuio da efetividade des-sas drogas no futuro (VELASQUEZ et al., 1995).

    Estudos epidemiolgicos realizados tanto em pases desenvolvidos quanto em desenvolvi-mento sugerem a existncia de cepas com diferentes graus de patogenicidade e distintas respos-tas dos afetados pela bactria.

    Sintomatologias clnicas variadas indicam a existncia de diferentes mecanismos de virulncia entre as cepas de distintas regies geogrficas. O C. jejuni considerado mais virulento devido a sua resistncia fagocitose, seguido de C. coli.

  • Manual Tcnico de Diagnstico Laboratorial de Campylobacter

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    Muitas cepas podem invadir as clulas epiteliais, causando inflamaes na prpria lmi-na e abscessos nas criptas semelhantes aos produzidos por Shigella, aparecendo hemcias e leuccitos nas fezes (diarreia inflamatria e disenteria). Podem atravessar a mucosa intestinal e proliferar na lmina prpria e nos gnglios, semelhante infeco por Salmonella (infeces extraintestinais), embora a ao do soro iniba a bacteremia na maioria dos casos.

    As espcies C. jejuni, C. coli e C. lari produzem fator citotnico que semelhante s en-terotoxinas CT de Vibrio cholerae e LT de Escherichia coli, enteropatognica ETEC, capazes de estimular a adenilciclase e provocar acmulo de adenosina 3,5-monofosfato cclico (cAMP ou AMP, responsvel por alteraes nos processos secretrios e absortivos da mucosa intestinal (RUIZ-PALACIOS et al., 1983) Esta toxina tem massa molecular entre 60 KDa e 70 KDa, sendo completamente inativada em pH 2 e 8; produz resposta citotnica nas clulas de tumor adrenal de camundongos (Y-1), nas clulas de ovrio de hamster chins CHO e Vero com produo de secreo fluida em ligadura de ala intestinal de coelhos e ratos, aumentando a permeabilidade no teste drmico em coelhos. O nvel de produo dessas enterotoxinas nas cepas de campi-lobacteres est entre 20 e 200 vezes menor do que para LT ou CT (JOHNSON; LIOR, 1986) e parcialmente neutralizado pelo anticorpo para CT ou LT. Alm dessa toxina, essas espcies produzem citotoxina, sensvel a tripsina e txica para clulas de rim bovino, Vero e HeLa. A citotoxina lbil a 70C, por 30 minutos; estvel a 60C, por 30 minutos e no neutralizada pelo antissoro para Shiga Toxin (Shigella dysenteriae), Clostridium difficile Toxin ou verotoxin (E. coli). Tanto a enterotoxina quanto a citotoxina so produzidas por espcies termoflicas.

    Alm das enterotoxinas e das citotoxinas, outra substncia termolbil sensvel a tripsina e no dializvel, a Cytolethal Distending Toxin CLDT est presente em filtrados de culturas de muitas cepas de C. jejuni, C. coli e C. lari. A CLDT citoletal para clulas CHO, Vero, HeLa e Hep2, mas negativas para Y-1, assim como para o acmulo de fluidos em ligadura de ala in-testinal de coelhos adultos, camundongos latentes e no teste intradrmico de coelhos. A CLDT tem sido a toxina mais estudada por causar aumento e distenso de clulas, sendo inativadas por aquecimento a 70C durante 15 minutos e por tripsina.

    Foi demonstrada a existncia de plasmdeos em clulas de C. jejuni, embora o seu papel e sua funo na doena ainda no estejam esclarecidos. Estudos experimentais, em camundongos e pintos, indicaram que C. jejuni localiza-se nas criptas contendo muco, onde se realiza a coloni-zao, sem aderncia s clulas epiteliais das microvilosidades (LEE, 1986). A grande motilidade e a forma espiralada facilitam a colonizao do muco. O C. jejuni atrado quimiotaxicamente pela mucina, podendo utiliz-la como substrato para crescimento. Experimentalmente, a colonizao das criptas cecais pelo C. jejuni diminuda ou impedida pela colonizao de Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae e Citrobacter diversus que ocupam os mesmos nichos ecolgicos, produzindo metablitos antagonistas do C. jejuni.

  • 15

    Campylobacter fetus

    Campylobacter fetus subespcie fetus est primariamente associada bacteremia e s in-feces extraintestinais em pacientes com doenas de base, mas estando tambm relacionada com processos de aborto sptico, artrite sptica, abscessos, meningites, endocardites, aneuris-mas, tromboflebites e peritonites. Embora a gastrenterite possa ocorrer com essa variante, a incidncia , provavelmente, subestimada porque esta espcie no cresce bem a 42C e apre-senta sensibilidade a cefalotina, antimicrobiano usado em alguns meios seletivos comuns para a cultura de fezes.

    Campylobacter fetus subespcie venerealis raramente tem sido isolada de infeces hu-manas, sendo o agente causador de campilobacteriose venrea em bovinos, determinando in-fertilidade. A diferena entre as subespcies a capacidade de crescimento da subespcie fetus em meio de glicina a 1%.

    Campylobacter hyointestinalis

    Anteriormente, esta espcie somente era isolada de animais, sendo o agente causador de doenas como ilete em porcos. Atualmente, tem sido recuperada de swabs retais de ho-mossexuais masculinos com sintomas de proctite. Campylobacter hyointestinalis apresenta reaes bioqumicas similares espcie C. fetus subespcie fetus, diferenciando-se pelo seu crescimento a 42C e produo de H2S em meio TSI Triple Sugar Iron.

    Campylobacter consisus e Campylobacter rectus

    A espcie Campylobacter consisus tem sido relacionada principalmente s doenas per-iodontais, contudo tambm tem sido isolada de pacientes com bacteremia. Seu papel em doenas diarreicas ainda no est bem estabelecido e alguns estudos sugerem que o mi-crorganismo no patognico ao homem (ENGBERG et al., 2000; GOOSENS et al. 1990; STEELE; OWEN, 1988; VAN ETTERIJCK, 1996). A espcie C. rectus tem sido primariamente isolada de pacientes com infeces periodontais ativas, mas tambm de infeces pulmonares (RAMS; FEIK; SLOTS, 1993).

    6 Principais Espcies Associadas s Infeces Humanas

  • Manual Tcnico de Diagnstico Laboratorial de Campylobacter

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    Campylobacter upsaliensis

    Esta uma espcie termotolerante que raramente isolada de diarreias, mas produz bac-teremia em pacientes imunocomprometidos. So mais resistentes ao poder bactericida do soro que as outras espcies termfilas, razo pela qual podem sobreviver no sangue. A sua fonte de infeco ainda no se encontra bem estabelecida, mas parece estar relacionada ao convvio com animais, especialmente ces, e consumo de leite no pasteurizado e seus derivados.

    Campylobacter jejuni e Campylobacter coli

    Campylobacter jejuni subespcie jejuni o agente causal de diarreias, sendo considerado o mais virulento devido a sua maior resistncia a fagocitose, e a subespcie doylei diferencia-se da subespcie jejuni pela sua incapacidade de reduzir nitrato a nitrito e no crescer temperatura de 42C, sendo raramente recuperada de pacientes com infeces gastrointestinais.

    Campylobacter coli produz uma diarreia mais branda do que o C. jejuni. Ambos encontram-se como comensais do trato intestinal de um amplo grupo de animais, principalmente todas as variedades de aves de criao devido a sua adaptao temperatura de 42C a 43C.

    O espectro da doena provocada por estas espcies pode variar desde casos assintomticos queles mais severos. As infeces sintomticas normalmente so autolimitantes, porm as re-cadas podem ocorrer em 5% a 10% dos pacientes no tratados.

    Infeces extraintestinais tm sido descritas seguidas de enterites e incluem bacteremia, hepatite, colecistite, pancreatite, aborto, sepse neonatal, sndrome hemoltica urmica, ne-frite, prostatite, infeces do trato urinrio, peritonite, miocardite, artrite sptica e formao de abscessos (SKIRROW; BLASER, 2000). A bacteremia tem sido relatada em uma propor-o de 1,5/1000 casos de infeces, sendo que a maior incidncia ocorre em pessoas idosas (SKIRROW et al., 1993). A doena diarreica persistente e a bacteremia podem ocorrer em hospedeiros imunocomprometidos, bem como em pacientes portadores do HIV.

    Campylobacter lari

    Esta espcie tem sido isolada do intestino de gaivotas, assim como de outros animais e do homem, porm a patogenicidade humana ainda no foi totalmente elucidada. Esta espcie diferencia-se das demais pela reao negativa na prova de hidrlise do substrato indoxil-acetato e pela sua resistncia natural ao cido nalidxico.

  • 17

    Os estudos voltados para analisar a presena de Campylobacter spp. em alimentos foram iniciados em 1972 e na atualidade esta avaliao visa identificao e ao controle das principais fontes: carnes, aves, leite e gua. Isso se deve ao fato de que estes microrganismos compem a microbiota intestinal de bovinos, ovinos, sunos, ces, gatos, aves domsticas e silvestres.

    Entre esses, as aves so os principais reservatrios de C. jejuni. Esses microrganismos podem ser encontrados nas fezes e nas carcaas de aves abatidas, contudo nos ovos a con-taminao pouco provvel. Apesar de reconhecidos em aves, estas so tidas como portado-ras assintomticas por no apresentarem, em nenhuma oportunidade, sinais clnicos. Outro reservatrio reconhecido representado pelos sunos, os quais so os principais veiculadores de C. coli e C. jejuni.

    Os bovinos geralmente contm C. jejuni em suas fezes, ocorrendo contaminao das car-caas durante os procedimentos de abate e eviscerao, porm, sua frequncia inferior quela detectada em aves e sunos. De modo semelhante, o leite pode ser contaminado a partir de fezes e causar gastrenterite quando consumido sem pasteurizao.

    Prticas tecnolgicas inadequadas na cadeia produtiva de alimentos de origem animal con-tribuem para a propagao do microrganismo nos alimentos e nos derivados de animais. Na produo de carne, o nvel de contaminao por C. jejuni e C. coli cai consideravelmente a partir do armazenamento sob refrigerao. Isso compreensvel, considerando que a temperatura tima para o crescimento de Campylobacter spp. elevada (42C a 43C), com exigncia de uma temperatura mnima de 30C.

    De um modo geral, os animais e as aves utilizados como alimentos esto sujeitos a con-taminaes por uma grande variedade de microrganismos patognicos, incluindo o gnero Campylobacter. Por essa razo, o controle dos alimentos deve ser realizado em todas as fases da cadeia de produo, distribuio e armazenamento, bem como informaes adicionais para o preparo adequado e o consumo final pelo consumidor.

    Medidas higinico-sanitrias aplicadas no local de produo podem reduzir o patgeno, por exemplo, o fornecimento de gua clorada para as aves, o que tem se mostrado efetivo na

    7 Os Alimentos como Fonte de Infeco

  • Manual Tcnico de Diagnstico Laboratorial de Campylobacter

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    reduo da carga microbiana. O transporte das aves para o abatedouro representa uma etapa que envolve risco de infeco entre os animais. Estes riscos individuais ou associados podem ser diminudos pela estrita ateno higiene e sanitizao de veculos e gaiolas, bem como a reduo do stress dos animais durante o transporte.

    A contaminao pode ocorrer no abate devido a processos inadequados durante a evis-cerao, a depenagem e o resfriamento. A separao de operaes (reas sujas e limpas) e boas prticas de processamento contribuem para a minimizao das contaminaes. Alm disso, tratamentos qumicos e fsicos tm sido empregados no processamento tecnolgico de alimen-tos. A sanitizao de carnes de aves pode ser realizada utilizando-se cloro, cido actico e cido ltico. A radiao ionizante com aplicao de dose de 3.0 kGy tem sido proposta para o controle desse patgeno nas carcaas de frango.

    Embora a aplicao de boas prticas de produo e processamento minimize a contami-nao de carcaas de frangos, a educao e a conscientizao dos consumidores na manipulao correta destes produtos so de fundamental importncia no controle e na preveno de doenas causadas por esse patgeno. Falhas durante transporte, armazenamento e manipulao (coco inadequada e contaminao cruzada) podem favorecer a multiplicao do patgeno e, conse-quentemente, a ocorrncia de surtos.

  • 19

    Requisitos essenciais para o cultivo e a identificao

    Composio dos meios seletivos

    O desenvolvimento do meio de Skirrow foi a chave para o sucesso no estudo de campilo-bacteres termotolerantes. Este meio contm peptonas como fonte de nutrientes, sangue lavado de cavalo e antibiticos para prevenir o crescimento de outros microrganismos. Estes ingredi-entes formam a base para a maioria dos meios de uso comum no isolamento de Campylobacter (POST, 1995)

    Todo meio utilizado para o isolamento de Campylobacter deve conter peptonas e antibiti-cos; a maioria contm sangue e muitos incluem agentes que capturam o oxignio (superxido e perxido de hidrognio) para superar seus efeitos txicos nestas espcies.

    Fonte de nutrientes

    Tendo em vista que a espcie Campylobacter no fermenta carboidratos, as peptonas so includas no meio como fonte de nutrientes. O caldo Preston (BOLTON; ROBERTSON, 1982) e o Exeter (MARTIN et al., 1996) contm extratos de carne e peptona. Os caldos Bolton e Campylobacter Enrichment Broth CEB tm uma formulao que consiste de peptonas, ex-trato de levedura e cido alfa-cetoglutrico, um intermedirio do ciclo do cido tricarboxlico.

    Sangue

    Muitos meios utilizados para o isolamento de Campylobacter contm sangue (5% a 7% - v/v) para capturar os componentes txicos do oxignio que podem ser formados quando o meio exposto luz. O sangue de cavalo tem-se mostrado mais eficaz.

    Antibiticos

    A incluso de antibiticos no meio de isolamento crucial para a recuperao de Campylobacter. Esta espcie resistente a alguns antibiticos incluindo a vancomici-na (inibe os cocos Gram-positivos), polimixina B (inibe a famlia Enterobacteriaceae e

    8 Diagnstico Laboratorial

  • Manual Tcnico de Diagnstico Laboratorial de Campylobacter

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    Pseudomonas spp.), trimetoprim (inibe Proteus e cocos Gram-positivos) e cefalospori-nas (inibem Enterobacter spp., Yersinia enterocolitica, Serratia spp., Pseudomonas aer-uginosa e algumas espcies de Proteus). A rifampicina foi substituda por vancomicina no meio Preston, visto que alguns estudos tm demonstrado que a rifampicina pode ser inibidora de clulas estressadas de C. jejuni (HUMPHREY; CRUICKSHANK, 1985; HUMPHREY, 1990).

    Antibiticos que inibem mofos e leveduras so usualmente includos nos meios para Campylobacter. At recentemente, a cicloheximida foi o antifngico mais amplamente utiliza-do, mas agora considerado txico para incluso em meios microbiolgicos. Como substitutos existem a anfotericina B, demonstrada como um substituto satisfatrio para a cicloheximida (MARTIN et al., 2002) ou a natamicina.

    Um nmero de antibiticos comumente usados nos meios para isolamento de Campylobacter podem adversamente afetar a recuperao de algumas espcies ou cepas. Nachamkin, Engberg e Aarestrup (2000) descreveram que a cefalotina, a colistina e a polimixina B podem inibir al-gumas cepas de C. jejuni e C. coli e tambm C. fetus subespcie fetus, C. jejuni subespcie doylei e C. upsaliensis.

    Atmosfera de incubao

    Existem vrios mtodos para obter uma atmosfera adequada ao crescimento do Campylobacter, contudo, devido praticidade do uso tem-se adotado com maior frequn-cia a utilizao de envelopes geradores de gases, comercialmente disponveis (BBL, Oxoid, Bio-Merieux).

    Substituio de uma atmosfera normal por uma mistura apropriada de gases: retira-se o ar contido na jarra de anaerobiose com bomba de vcuo e efetua-se a substituio por uma mistura contendo 85% de nitrognio, 10% de dixido de carbono e 5% de oxignio.

    Utilizao de geradores de gases comerciais especiais para Campylobacter: BBL, Oxoid, Bio-Merieux e Probac, cuja atmosfera aproximada de 5% a 10% de oxignio e de 5% a 12% de dixido de carbono.

    Geradores de hidrognio e oxignio para anaerobiose: o qual utilizado sem o catalizador de paldio.

    Geradores opcionais: para jarra de 2,5l de capacidade: metade de um bombril embebido em soluo de sulfato de cobre saturado

    (previamente preparada) ou metade de um Alka-Seltzer (em uma placa) acrescida de soluo de sulfato

    de cobre ou um comprimido de Sonrisal macerado (em uma placa) o qual ser introduzido

    na jarra acrescida de soluo de sulfato de cobre.

  • Manual Tcnico de Diagnstico Laboratorial de Campylobacter

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    Soluo de sulfato de cobre

    Sulfato de cobre anidro 25ggua destilada 500mLH2SO4 1,6gTween 80 1,0mL

    A metodologia inclui incubao das placas em atmosfera de microaerofilia (5% a 6% de oxignio; 10% de dixido de carbono; 84% a 85% de nitrognio) requerida pelo Campylobacter e em elevadas temperaturas de 42C a 43C para seleo das espcies termotolerantes.

    Amostras clnicas

    O diagnstico para a deteco do microrganismo pode ser realizado pelo exame direto ou cultivo. O uso de mtodos sorolgicos para o diagnstico em alguns casos somente tem valor para pesquisa, j que nos pases em desenvolvimento podem ser detectados elevados ttulos na populao. O exame direto consiste na utilizao de microscpio de campo escuro ou contraste de fase das amostras fecais, coletadas at duas horas aps sua evacuao, permitindo um diag-nstico presuntivo rpido quando observada a motilidade do tipo saca-rolha ou vaivm, em sua maioria acompanhada por eritrcitos e neutrfilos.

    Para cultivo e isolamento a partir de material fecal requerida uma atmosfera de microaerofilia, meios de cultivo seletivos para inibir a flora acompanhante, temperatura tima de desenvolvimento (42C a 43C), ainda que possam desenvolver a 37C, pH timo de crescimento (6,5 a 6,9).

    Coleta e transporte de material

    A coleta da amostra pode ser realizada utilizando swab retal ou por evacuao espontnea, devendo ser processada o mais rpido possvel, visto que o gnero Campylobacter extrema- mente sensvel ao oxignio. Em pacientes hospitalizados o exame realizado em uma nica amostra usualmente fornece resultados positivos, entretanto caso ocorra intervalo entre a cole-ta e a anlise laboratorial superior a duas horas necessria a utilizao de meios de transporte. O meio de transporte tambm sugerido quando a amostra coletada por meio de swabs retais ou quando as fezes in natura no podem ser processadas imediatamente aps a coleta.

    Muitos meios de transporte tm sido descritos para Campylobacter, incluindo gua peptonada alcalina com tioglicolato e cistina, meio de Stuart modificado e meio de Cary e Blair. Entretanto, uma modificao do meio de Cary e Blair na qual empregada a concentrao de 1,6 g/L de gar, vem demonstrando melhores resultados para a recuperao de Campylobacter e de outros enteropatgenos.

  • Manual Tcnico de Diagnstico Laboratorial de Campylobacter

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    As amostras recebidas em meio de Cary e Blair devem ser armazenadas a 4C se o proces-samento no for realizado imediatamente. O uso deste meio suplementado com sangue des-fibrinado de carneiro pode ser til para um armazenamento prolongado de amostras fecais e recuperao de C. jejuni.

    Exame microscpico direto

    As amostras fecais podem ser examinadas por meio de uma colorao simples como Gram (Figura 1), utilizando carbol fucsina ou soluo aquosa a 0,1% de fucsina como corante para evidenciao do microrganismo e azul de metileno para identificar leuccitos e formas ba-cilares curvas.

    A observao em microscpio de contraste de fase ou de campo escuro de bacilos curvos espiralados com grande motilidade em forma circular ou de saca-rolhas permite um diagns-tico presuntivo rpido.

    Semeadura direta

    Alquotas de fezes diarreicas ou do swab de transporte podem ser semeadas, em duplicata, diretamente em placa de gar seletivo para Campylobacter, porm normalmente se prepara uma suspenso em soluo tampo (soluo salina ou gua peptonada de 0,1%) e se utiliza duas a trs gotas desta suspenso para a semeadura. No existe necessidade de pesar as fezes com pre-ciso, contudo indicado que a suspenso obedea proporo de 1/10 (p/v) para que se possa detectar a presena do microrganismo. As placas em duplicata devero ser incubadas por 48 horas em microaerofilia nas temperaturas de 37C e 42C.

    Mtodo de filtrao para a deteco de Campylobacter em fezes

    Esta tcnica foi desenvolvida por Steele e McDermott (1984), sendo baseada na separao do Campylobacter da flora bacteriana acompanhante. Nesta, os coliformes ficam retidos na su-perfcie da membrana de celulose (0,45 mm ou 0,66 mm) enquanto os campilobacteres tm a capacidade de migrar pelos poros desta membrana e se depositarem sobre a placa que atuar como substrato para o seu crescimento. Este mtodo recomendado para o isolamento das espcies emergentes como Campylobacter upsaliensis.

    Procedimento

    Com auxlio de uma pina colocar o filtro de celulose (0,45 mm) esterilizado na superfcie de uma placa de gar seletivo de modo que fique aderido ao meio. Preparar uma suspenso do material fecal em soluo fisiolgica e com auxlio de micropipeta, depositar 100 mL sobre a membrana, tendo cuidado para que a soluo no derrame sobre o meio. Deixar filtrar por 30 minutos, adicionar mais 100 mL e esperar mais 30 minutos. Retirar a membrana (utilizando

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    uma pina), descart-la e estriar o filtrado com ala. Acondicionar as placas em jarras e incubar durante 24 a 48 horas, podendo esperar at quatro ou cinco dias, em microaerofilia a 37C.

    Observao: Se a amostra for proveniente de diarreia aquosa, no necessrio o preparo da suspenso.

    Enriquecimento

    Alimentos e amostras ambientais usualmente contm um baixo nmero de clulas de Campylobacter. O uso de pr-enriquecimento no protocolo laboratorial parece aumentar a re-cuperao deste microrganismo (BOLTON; COATES; HUTCHINSON, 1984), tendo sido reco-mendado geralmente para a anlise de alimentos, gua e outras amostras ambientais.

    O pr-enriquecimento usualmente comea com a restaurao das clulas danificadas por procedimentos que envolvam secagem, aquecimento, congelamento e exposio ao oxignio. O procedimento mais amplamente utilizado consiste de uma incubao a 37C durante qua-tro horas (HUMPHREY, 1989; BOLTON, 2000) e, em seguida, a 42C. necessrio que o tempo de 4 horas seja limitante para prevenir o crescimento exagerado de contaminantes (GOOSENS; BUTZLER, 1992).

    Para amostras clnicas, alguns meios de enriquecimento vm sendo apontados para per-mitir mais facilmente a recuperao de Campylobacter em fezes, incluindo o caldo Preston, o caldo Bolton, o Campylobacter Enrichment Broth e o caldo Park e Sanders. Estes so indicados para recuperar reduzido nmero de clulas resultante de transporte inadequado, aps o estgio agudo da infeco. Entretanto, seu uso na rotina deve ser avaliado tendo em vista que os resul-tados apontados na literatura indicam sua utilizao em reduzido nmero de amostras.

    Em material fecal proveniente de pacientes previamente tratados com antibitico, necessrio fazer uma etapa reconstituinte da estrutura celular. Esta reconstituio deve ser realizada em meio contendo caldo Brucella, succinato de sdio a 0,3%, cistena (0,01%) e uma mistura de antibiticos que no contenha antimicrobianos que exeram efeito inibidor sobre as clulas injuriadas, como o caso da polimixina e da rifampicina. A incubao deve ser a 37C por um perodo de pelo menos seis horas.

    Caldo PrestonAs investigaes realizadas por Bolton e Robertson (1982) revelaram que o Agar de Skirrow

    era insuficientemente seletivo para a recuperao de clulas de Campylobacter oriundas de amostras animais e ambientais e descreveram o meio Preston como uma alternativa efetiva. O meio de Preston pode ser usado tanto como um caldo para pr-enriquecimento quanto como um gar para isolamento seletivo de colnias. O meio de Preston baseado em um caldo nu-triente que no possui extrato de levedura, um conhecido antagonista do trimetoprim, e inclui 5% (v/v) de sangue lisado de cavalo e os antibiticos polimixina B, rifampicina (usada para

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    suprimir o crescimento de bactrias Gram-positivas), trimetoprim e cicloheximida. A incu-bao feita em atmosfera de microaerofilia a 42C.

    Uma modificao formulao original de Preston foi a incluso do piruvato de sdio, metabissulfito de sdio e sulfato ferroso FBP. Esta incluso permitiu a incubao aerbica e tambm a estocagem do caldo por at sete dias a 4C.

    Atualmente, a formulao do caldo de Preston, acrescido do suplemento FBP, parece ser o mais amplamente usado (BAYLIS et al., 2000). Os componentes do caldo Preston esto disponveis comercialmente e compreendem: caldo Preston desidratado, suplemento FBP, su-plemento de antibiticos, em que a cicloheximida tem sido substituda pela anfotericina B e sangue de cavalo.

    O protocolo para o pr-enriquecimento em caldo Preston usa incubao aerbica a 37C por 4 horas, seguida pela incubao a 42C por 48 horas (BAYLIS et al., 2000).

    Caldo BoltonO caldo Bolton recomendado nos protocolos produzidos pela Food and Drug Administration

    FDA-USA (1998) para a recuperao de Campylobacter de uma grande variedade de tipos de amostras. O meio bsico e os suplementos esto disponveis comercialmente.

    O caldo Bolton desidratado contm peptona e extrato de levedura, cido alfa-cetoglutmi-co, piruvato de sdio, metabissulfito de sdio, carbonato de sdio (serve para fornecer dixido de carbono durante o crescimento) e hemina, que foi includa para superar o antagonismo do trimetoprim ao extrato de levedura. O meio completo tambm inclui 5% de sangue de cavalo e os antibiticos cefoperazona, vancomicina, trimetoprim e cicloheximida.

    O protocolo do FDA-USA (1998) especifica a necessidade de atmosfera em microaerofilia para a incubao. Para a maioria das amostras, o perodo de recuperao das clulas consiste de uma incubao a 37C durante quatro horas, sendo transferido em seguida para uma incubao a 42C durante 28 a 29 horas para a maioria dos tipos de amostras e 44 horas para produtos lcteos. Na anlise de mariscos, a primeira incubao realizada 30C por trs horas, seguida de 37C por 2 horas e, finalmente, a 42C durante 48 horas.

    Campylobacter Enrichment Broth CEBEste caldo pode ser encontrado comercialmente e possui a mesma formulao do caldo

    Bolton, variando apenas na composio do suplemento de antibiticos em que a natamicina substitui a cicloheximida.

    Observao: Caldos de pr-enriquecimento que contenham o suplemento FBP podem ser incubados aerobicamente (em tubos ou frascos com espao de cabea < 1 cm) por 4 horas, a 37C, para permitir a recuperao das clulas, seguida por outra incubao de 20 a 44 horas, a 42C (BAYLIS et al., 2000).

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    Caldo Park e SandersA formulao bsica do caldo Park e Sanders o Caldo Brucella (Difco) contendo peptonas,

    glicose, extrato de levedura, piruvato de sdio metabissulfito de sdio. Antes da inoculao da amostra devem ser adicionados ao meio 5% de sangue lavado de cavalo (v/v) e dois antibiti-cos, vancomicina e trimetoprim (ambos na concentrao de 10mg/L). O perodo inicial de incubao de 4 horas a 32C, aps o qual dois outros antibiticos, cefoperazona (32mg/L) e cicloheximida (100mg/L), tambm so adicionados ao caldo que deve ser transferido para a temperatura de 37C durante 4 horas. Decorrido o tempo, o caldo dever ser transferido nova-mente para 42C em um perodo de 40 a 42 horas.

    Todas as trs etapas de incubao devem ser realizadas em atmosfera de microaerofilia de acordo com a International Organization for Standardization (ISO 10272-1, 2006). O uso deste meio recomendado para amostras submetidas a tratamentos que podem ocasionar algum tipo de estresse nas clulas, como o congelamento.

    Semeadura em gar seletivoAps o pr-enriquecimento, quando necessrio, o isolamento realizado por meio de se-

    meadura por estrias em placas de gar seletivo para Campylobacter, utilizando swabs esteriliza-dos. Na maioria dos protocolos, uma alada do crescimento em caldo estriada na superfcie da placa de gar seletivo, de forma a obter colnias isoladas. Existe uma variedade de meios seletivos para Campylobacter.

    Embora numerosas formulaes de meios tenham sido descritas na literatura, ressalta-se aquelas que tenham sido usadas recente ou frequentemente:

    Meios que incluem sangue (usualmente 5% a 7% v/v) lavado de cavalo: skirrow, campy-cefex, butzler (ou butzler modificado), Preston e Exeter;

    Meios livres de sangue: Agar Karmali ou mCCDA modified Charcoal, Cefoperazone, Deoxicolato gar (Figura 2).

    Amostras de alimentos

    As tcnicas de isolamento de Campylobacter jejuni e Campylobacter coli em alimentos ne-cessitam de meios de enriquecimento para recuperao das clulas lesadas metabolicamente. Os alimentos a serem analisados podem estar altamente contaminados com flora competitiva tornando difcil o isolamento de Campylobacter. Alm disso, o nmero do microrganismo pode estar presente em pequena quantidade ou as clulas podem estar injuriadas como consequn-cia das condies ambientais de armazenamento e processamento (aquecimento, dessecao, congelamento e acidificao).

    Em geral, so incorporados antibiticos nos meios de cultura como agentes seletivos entre os quais trimetoprim, vancomicina, anfotericina, cefalotina, polimixina B, actidiona, colistina e

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    rifampicina. So adicionados tambm suplementos como: sulfato ferroso, metabissulfito de sdio, piruvato de sdio (suplemento FBP), cistena, hematina, sangue de cavalo e extrato de levedura.

    Alimentos congelados ou refrigerados devem ser pr-incubados por pelo menos 6 horas a 37C em microaerofilia, evitando-se os meios que contenham polimixina ou rifampicina, uma vez que clulas submetidas ao frio sofrem alteraes tornando-se sensveis temperatura de 42C e a esses antibiticos.

    Amostras embaladas podem ser conservadas refrigeradas e protegidas do ar por uma a trs semanas. Aps a abertura da embalagem, a amostra deve ser analisada, pois a introduo do oxignio provoca dano celular.

    Enriquecimento seletivo

    Carnes bovina, suna ou avesPara anlise destes alimentos, alquotas de 25g da amostra devem ser homogeneizadas em

    100mL de caldo de enriquecimento seletivo, seguindo-se a incubao a 42C por 48 horas em atmosfera de microaerofilia. Para carcaas, podem ser utilizadas lavagens com gua peptonada tamponada (carcaas de 1kg a 2 kg utilizar 100mL a 400mL do diluente), sendo retirados 25mL da rinsagem e colocados em 25mL de meio de enriquecimento em concentrao dupla.

    Alimentos congeladosPark e Sanders desenvolveram um mtodo de enriquecimento seletivo com uma etapa de

    reparao de clulas injuriadas que recomendado pelos autores para frangos congelados. A preparao da amostra deve ser efetuada conforme procedimento descrito no item anterior em-pregando, para tal, caldo de enriquecimento isento de agentes seletivos. As amostras coletadas devem ser submetidas a uma incubao inicial de 31C a 32C durante trs ou quatro horas em atmosfera de microaerofilia, sem agitao, seguindo-se a adio da cefoperazona (32mg/l) e da cicloheximida (100mg/l), com nova incubao, sem agitao, em microaerofilia a 35C-37C por duas horas e em seguida, incubao a 42C por um perodo de 40 a 42 horas sob agitao.

    Alimentos lquidos com exceo da guaA anlise de alimentos lquidos deve ser precedida de centrifugao de 250mL da amostra

    a 16.000 x g durante 20 minutos a 4C. O sobrenadante deve ser desprezado e o precipitado suspenso em 2mL a 5mL de caldo de enriquecimento. Em seguida, proceder conforme metodo-logia descrita no item 1.

    guaPara isolamento da bactria em amostras de gua necessrio que se realize a filtrao de

    um grande volume de gua (1 litro a 4 litros) em membrana filtrante que, aps a filtragem, deve ser colocada em um meio de enriquecimento seletivo e este, incubado de 24 a 48 horas a 42C em microaerofilia. O crescimento obtido dever ser semeado em gar seletivo. Se a gua for

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    clorada, devem ser adicionados 5mL de tiossulfato de sdio 1M por litro de gua no momento da coleta. Para gua do mar ou com alto teor de sal, lavar o filtrado com 100mL a 1000mL de tampo fosfato estril. Campylobacter sensvel a altas concentraes de sal. Para isolar esse microrganismo de rios, o uso de mecha de Moore tambm recomendvel.

    Semeadura em meios slidos diferenciais

    A partir do caldo de enriquecimento, estriar uma alada em placa de Agar Blaser (Campy-BAP) e uma alada em placa de Agar Campylobacter Charcoal Diferencial CCDA. Opcional-mente, podem ser utilizados o gar Skirrow e o gar Butzler em substituio ao CCDA ou Campy-BAP. Acondicionar as placas em jarra com atmosfera de microaerofilia e incubar a 42C.

    Exame das placas

    O tempo de incubao ideal de 48 horas, porm podem ser examinadas em 18-24 horas. As colnias suspeitas de Campylobacter nos diversos meios so semelhantes, podendo ser lisas, convexas e brilhantes, com bordas perfeitas, ou planas, translcidas e lustrosas, com bordas irregulares e tendncia a disseminar-se pela placa. Geralmente so incolores, com tonalidades creme ou acinzentada cujo dimetro das colnias varia de 1mm a 2mm, podendo ainda apre-sentar-se puntiformes. Nos meios contendo sangue (gar, segundo Blaser, Skirrow ou Butzler) no existe a presena de hemlise.

    Identificao presuntiva do gnero

    As colnias suspeitas devem ser submetidas ao exame de morfologia microscpica pela colorao de Gram, em que a safranina substituda pelo carbol fucsina. As espcies do gnero Campylobacter so Gram-negativos (Figura 1), bacilos curvos, espiralados, muito finos e com-pridos (0,20nm a 0,50nm de largura e 0,5nm a 5,0nm de comprimento). Em culturas jovens possvel a observao da morfologia em forma de asa de gaivota, S ou cedilha.

    O movimento tpico em saca-rolha dever ser visualizado em microscopia de contraste de fase, pelo esfregao da colnia em lmina de vidro com soluo salina 0,9%.

    ConfirmaoColnias que apresentarem caractersticas compatveis ao gnero Campylobacter devero

    ser submetidas ao teste de sensibilidade aos antibiticos cefalotina (30mg) e cido nalidxico (30mg), assim como s seguintes provas para a caracterizao final: catalase, oxidase, fermen-tao da glicose, reduo de nitrato, produo de H2S, hidrlise do hipurato.

    Teste de catalaseColocar uma gota de perxido de hidrognio em uma lmina de vidro; adicionar gota o

    crescimento bacteriano proveniente da placa, com o auxlio de uma ala de platina ou plstica. A positividade do teste verificada pela formao de bolhas no perodo de at 30 segundos (Figura 3).

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    Teste de oxidaseAdicionar uma gota de reagente (soluo aquosa de dimetil--fenilenodiamina) em uma

    tira de papel de filtro, previamente esterilizada. Com o auxlio de um palito de madeira, plstico ou ala de platina, espalhar a amostra a ser testada sobre o papel impregnado com o reagente. O resultado positivo observado pelo aparecimento de cor roxa (Figura 4). A reao deve ser interpretada em 10 a 20 segundos aps a semeadura, visto que alguns membros das enterobac-tericeas podem produzir reaes falso-positivas tardias.

    TermotolernciaSemear a amostra, a partir de uma suspenso com turvao equivalente ao padro 1 da es-

    cala de McFarland, preparada em soluo fisiolgica esterilizada, em trs placas de gar sangue ou gar seletivo para Campylobacter. Incubar em atmosfera de microaerofilia cada placa nas temperaturas de 25C, 37C e 42C, respectivamente. Examinar, aps trs dias, a presena de colnias tpicas de Campylobacter.

    Uma alternativa o uso de 0,5mL desta suspenso em tubos contendo caldo Brucella. Aps os mesmos perodos de incubao, verificar o crescimento bacteriano pela turvao do caldo.

    Teste de sensibilidade a antibiticos (cido nalidxico e cefalotina)Preparar uma suspenso correspondente ao padro 1 da escala de McFarland, a partir do

    crescimento bacteriano em 5mL de gua peptonada 0,1%. Semear, com auxlio de um swab, toda a superfcie de uma placa de gar sangue, gar Muller Hinton ou outro meio seletivo para o crescimento de Campylobacter. Colocar sobre a semeadura os discos dos antibiticos em teste, incubar em microaerofilia a 37C de 24 a 48 horas. A sensibilidade verificada pela formao de qualquer halo de inibio.

    Hidrlise do hipuratoPreparar uma suspenso do crescimento em 0,4mL de uma soluo de hipurato de sdio a

    1%. Colocar os tubos em banho-maria a 37C durante duas horas, sob agitao.Preparar uma soluo de ninhidrina a 3,5% em butanol/acetona (1:1).Aps a retirada dos tubos da incubao, adicionar 0,2mL da soluo de ninhidrina, agitar e

    reincubar por mais 10 minutos, sem agitao. A positividade do teste verificada pela formao de colorao violeta nos tubos (Figura 5).

    Hidrlise do indoxil-acetatoPreparar uma soluo a 10% em acetona (p/v). Impregnar discos de 6mm de dimetro com

    50l da soluo e deixar secar. Preparar uma suspenso em 0,3mL de gua destilada, a partir do crescimento em placa.

    Adicionar um disco a cada tubo e aguardar por um perodo de 10 a 15 minutos. O aparecimento de colorao azul indica a hidrlise do composto (Figura 6).

  • Manual Tcnico de Diagnstico Laboratorial de Campylobacter

    29

    Produo de H2S Inocular a amostra com uma picada no centro da coluna do tubo de meio para H2S (gar

    TSI) e incubar a 37C em atmosfera de microaerofilia por at cinco dias. A positividade do teste verificada pelo enegrecimento do meio ao redor do inculo.

  • Manual Tcnico de Diagnstico Laboratorial de Campylobacter

    30

    Isolamento e identificao de Campylobacter em alimentos

    25g da amostra + 100mL do caldo deenriquecimento seletivo

    (Caldo Brucella * + FBP + antibiticos**)25g da amostra + 100mL de meio

    42C/48h (microaerofilia)

    Plaqueamento em gar seletivogar seletivo + suplemento seletivo (Merck)

    gar CCDA modificado (Oxoid)

    42C/48h (microaerofilia)

    Isolamento

    Identificao bioqumica

    *Substitudo por TSB 30gExtrato de levedura 2gCitrato de sdio 1g**Suplemento seletivo da cefar (vancomicina, trimetoprim, polimixina B, cefalotina, anfotericina)

  • Manual Tcnico de Diagnstico Laboratorial de Campylobacter

    31

    Quadro1 - Propriedades fenotpicas de Campylobacter spp. prevalentes no homem

    Prova

    C.fe

    tus s

    sp.fe

    tus

    C.h

    yoin

    test

    inal

    is

    C.je

    juni

    ssp.

    jeju

    ni

    C.je

    juni

    ssp.

    doyl

    ei

    C.c

    oli

    C.la

    ri

    C.u

    psal

    iens

    is

    Catalase + + + V + + -

    Reduo de NO3 + + + - + + +Produo de H2S (TSI) - + - - V - -

    Hidrlise do:

    hipurato - - + V - - -

    indoxilacetato - - + + + - +

    Crescimento :

    25C + V - - - - -

    37C + + + + + + +

    42C - V + - + + VSensibilidade:

    cido nalidxico V R S S S R S

    Cefalotina S S R S R R S

    R = Resistente S = Sensvel V = VarivelFonte: lorem ipsum lorem

    Quadro 2 - Caractersticas de espcies da famlia Campylobacteriaceae

    Cata

    lase

    Redu

    o

    Nit

    rato

    Redu

    o

    Nit

    rito

    Ure

    ase

    H2S

    (TSI

    )* *

    Hid

    rlis

    e

    Hip

    urat

    o

    Cres

    cim

    ento

    15C

    Cres

    cim

    ento

    25

    C

    Cres

    cim

    ento

    42

    C

    Cres

    cim

    ento

    3,5

    %

    NaC

    l

    Cres

    cim

    ento

    1%

    Glic

    ina

    ga

    r Mac

    Con

    key

    Sens

    ibili

    dade

    A

    c. N

    alid

    ixic

    o

    Sens

    ibili

    dade

    Ce

    falo

    tina

    C. jejuni subsp. jejuni + + - - - + - - + - + + S R

    C. jejuni subsp. doviei v - - - - v - - - - + - S S

    C. coli + + - - - - - - + - + + S R

    C. fetus subsp. fetus + + - - - - - + - - + + v S

    C. fetus subsp. veneralis + + - - - - - + - - - + R S

    C. lari + + - v - - - - + - + + R R

    C. upsaliensis + + - - - - - - + - v + S S*

    C. hyointestinalis + + - - + - - + + - + + R S

    (continua)

  • Manual Tcnico de Diagnstico Laboratorial de Campylobacter

    32

    Cata

    lase

    Redu

    o

    Nit

    rato

    Redu

    o

    Nit

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    Ure

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    H2S

    (TSI

    )* *

    Hid

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    o

    Cres

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    15C

    Cres

    cim

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    25

    C

    Cres

    cim

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    42

    C

    Cres

    cim

    ento

    3,5

    %

    NaC

    l

    Cres

    cim

    ento

    1%

    Glic

    ina

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    r Mac

    Con

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    Sens

    ibili

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    A

    c. N

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    o

    Sens

    ibili

    dade

    Ce

    falo

    tina

    C. sputorum blovar sputorum

    - + + - + - - - + - + + S S

    C. sputorum biovar bubulus

    - + + - + - - - + + + - R S

    C. sputorum biovar fecalis

    + + + - + - - - + - + + R S

    C. helveticus - + ND ND - - - - + v v ND S S

    C. mucosalis - + + - + - - - + - + + R S

    C. concisus - + + - + - - - + - + + R R

    C. curvus - + + - = - - - + - + ND S ND

    C. rectus - + + - + - - - +* - + ND S ND

    C. showae + + ND - + - - - + - v ND R S

    Arcobacter cryaerophi-lus grupo 1A

    + v - - - - + + - - - - v R

    A. cryaerophilus grupo 1B

    + v ND - - - + + - - - + S v

    A. nitrofigilis + + - - - - + + - + - - S SA. butzleri +* + - - - - + + v v + + S RA.skirrowii + + - - - + + v v v - S S

    * (reao fraca) S (sensvel) + (positivo) v (reao varivel) R (resistente) - (negativo) ND (No determinado)

    * * TSI (gar trs acares e ferro)

    Fonte: (FITZGERALD, C.; NACKAMKIN, I., 2007)

    Identificao molecular de Campylobacter spp.

    PCR Multiplex para diferenciao de C.jejuni e C.coliOs mtodos clssicos de identificao de C.jejuni e C.coli so muito lentos, j que na maioria

    dos testes so necessrios cinco dias para isolamento e caracterizao do microrganismo. Alm disso, a diferenciao de C.jejuni de outros microrganismos do mesmo gnero baseada no teste da hidrlise do hipurato, o que nem sempre permite definir uma identificao precisa, visto que j existem relatos sobre cepas de C. jejuni com ausncia da enzima hipuricase.

    (continuao)

  • Manual Tcnico de Diagnstico Laboratorial de Campylobacter

    33

    Tendo em vista tais dificuldades com os testes fenotpicos para a caracterizao em nvel de espcie de Campylobacter e o baixo espectro de provas bioqumicas aplicadas para este fim, muitos laboratrios tm utilizado ensaios baseados na biologia molecular para uma identifi-cao especfica destes microrganismos.

    O uso da reao de PCR, aplicada para a diferenciao das duas espcies de Campylobacter, mais comumente implicadas em gastrenterite de origem alimentar no homem, realizado segundo o protocolo da WHO, 2003.

    Extrao do DNAA extrao do DNA de cepas de Campylobacter pela tcnica de fervura bastante efi-

    ciente. Para tal, preparar uma suspenso bacteriana a partir da raspagem de colnias cresci-das em gar sangue a 42C, por 24 horas (microaerofilia), em 1mL de soluo fisiolgica e ajustar a uma DO de 625nm.

    Transferir a suspenso para um tubo de 1,5mL, agitar em vortex e centrifugar a 11.000 x g durante 5-8 minutos. Descartar o sobrenadante e suspender o pellet em 200l de gua deioni-zada. Submeter os tubos fervura (100C) durante 10 minutos e, em seguida, mant-los a -20C at a sua utilizao no ensaio.

    Reao da PCRO ensaio realizado para um volume final de 25 l/amostra, cuja distribuio de volume dos

    reagentes encontra-se listada a seguir:

    Quadro 3 - Volume dos reagentes empregados no preparo da mistura para amplificao

    Reagentes Volume (l) Concentrao final

    gua deionizada 5,25

    Tampo 50mm Tris-HCl 10X 2,5 1X

    dNTP (mix) 2,0

    Primer Jun3 2,5 1,0 M

    Primer Jun4 2,5 1,0 M

    Primer Col1 2,5 1,0 M

    Primer Col2 2,5 1,0 M

    Taq DNA polimerase 0,25 1,25 U/ensaio

    DNA 5,0 100 ng

    Volume final 25,0

    Fonte:

    Sequncias nucleotdicas utilizadas em pcr para Campylobacter

    Primer Col 1: 5 AGG CAA GGG AGC CTT TAA TC 3Primer Col 2: 5 TAT CCC TAT CTA CAA ATT CGC 3

  • Manual Tcnico de Diagnstico Laboratorial de Campylobacter

    34

    Primer Jun 3: 5 CAT CTT CCC TAG TCA AGC CT 3Primer Jun 4: 5 AAG ATA TGG CAC TAG CAA GAC 3

    Amplificao As condies de amplificao no termociclador devem ser determinadas segundo

    o protocolo: desnaturao: 94C/5min dois ciclos: 94C/1min; 64C/1min; 72C/1min dois ciclos: 94C/1min; 62C/1min; 72C/1min dois ciclos: 94C/1min; 60C/1min; 72C/1min dois ciclos: 94C/1min; 58C/1min; 72C/1min dois ciclos: 94C/1min; 56C/1min; 72C/1min 30 ciclos: 94C/1min; 54C/1min; 72C/1min Extenso final: 72C/10min. Manter a 4C.

    Alm das amostras para anlise, devem ser adicionados controles negativo, para evitar con-taminao (gua deionizada), e positivo, para controle de reaes falso-positivas (DNA conhecido).

    Aps a amplificao, deve ser realizada uma corrida eletrofortica em gel de agarose a 2% em tampo TBE 1x durante 40 minutos com potncia de 100v. Para preparo do gel de agarose, preparar a soluo e aquecer em banho-maria para fuso do gar, vertendo a seguir sobre o suporte especfico. Deixar resfriar por 20-30 minutos.

    A colorao do gel deve ser realizada com soluo aquosa de brometo de etdio (1g/mL) por 30 minutos, sendo posteriormente visualizado sob luz UV.

    Os tamanhos dos fragmentos amplificados so: 773 pb para C. jejuni e 364 pb para C. coli.

    PCR-Multiplex: tamanho dos fragmentos amplificados

    Fonte: (LABENT; IOC; FIOCRUZ)

  • 35

    9 Figuras

    Figura 1 - Campylobacter jejuni colorao pelo mtodo de Gram

    Figura 2 Crescimento de Campylobacter em gar modificado de carvo, cefoperazona e desoxicolato (mCCDA)

    (http://aapredbook.aappublications.org/content/images/large/2009/1/022_04.jpeg)

    (LRNEB/IOC/FIOCRUZ)

  • Manual Tcnico de Diagnstico Laboratorial de Campylobacter

    36

    Figura 3 - Teste para presena da enzima catalase

    Figura 4 - Teste para presena da enzima citocromo oxidase

    Figura 5 - Hidrlise do hipurato de sdio

    Figura 6 - Hidrlise do indoxil-acetato

    (LRNEB/IOC/FIOCRUZ)

    (LRNEB/IOC/FIOCRUZ)

    (LRNEB/IOC/FIOCRUZ)

    (LRNEB/IOC/FIOCRUZ)

  • 37

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    Campylobacter

    Man

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    o La

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    l de

    Cam

    pylo

    bact

    er

    MINISTRIO DA SADE

    Disque Sade

    0800.61.1997

    Biblioteca Virtual em Sade do Ministrio da Sade

    www.saude.gov.br/bvs

    Secretaria de Vigilncia em Sade do Ministrio da Sade

    www.saude.gov.br/svs

    Braslia DF2011

    Ministrio daSade

    Secretaria deVigilncia em Sade

    ISBN 978-85-334-1793-9

    IntroduoHistricoCaractersticasGeraisCaractersticas EpidemiolgicasPatogenia e Fatores de VirulnciaPrincipais EspciesAssociadas s Infeces HumanasOs Alimentos como Fonte de InfecoDiagnstico Laboratorial FigurasREFERNCIAS

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