EXTRAO E CARACTERIZAO DE POLISSACARDEOS: Extrao e caracteizao do amido da batata e do glicognio heptico

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UNESP FACULDADE DE CINCIA E TECNOLOGIA FCT Campus de Presidente PrudenteUnespRelatrio de BioqumicaEXTRAO E CARACTERIZAO DE POLISSACARDEOS:EXTRAO E CARACTERIZAO DO AMIDO DE BATATA EXTRAO E CARACTERIZAO DO GLICOGNIO HEPTICODiscentes: Gabriela Bitto de Oliveira Jos Carlos de Oliveira Junior Tamara Murisugi de Oliveira Docente: Profa. Dra. Maria de Lourdes Corradi C. Da Silva Disciplina: Bioqumica Curso: Engenharia Ambiental 2 anoPresidente Prudente, 07 de abril de 2010ndice1. Introduo ......................................................................................................................................2 2. Objetivos .........................................................................................................................................4 3.Matrias ...........................................................................................................................................43.1. Extrao e caracterizao do amido da batata ................................................................................................4 3.2.Extrao e caracterizao do glicognio heptico ...........................................................................................44. Metodologias ..................................................................................................................................54.1. Extrao e caracterizao do amido da batata4.1.1. Extrao do amido ........................................................................................................................ 5 4.1.2. Preparo de uma soluo de amido. ............................................................................................... 5 4.1.3. Caracterizao do amido por reao de fenol cido sulfrico ......................................................5 4.1.4. Caracterizao do amido por reao com iodo .............................................................................5 4.1.5. Precipitao do amido por soluo saturada de sulfato de amnio ...............................................5 4.1.6. Precipitao do amido por lcool etlico ......................................................................................54.2. Extrao e caracterizao do glicognio heptico4.2.1. Extrao do glicognio heptico com KOH a quente ...................................................................6 4.2.2. Caracterizao Colorimtrica e Hidrlise Enzimtica do Glicognio ..........................................65. Resultados e Discusses .................................................................................................................75.1. Extrao e caracterizao do amido da batata5.1.1. Extrao do amido .........................................................................................................................7 5.1.2. Preparo de uma soluo de amido .................................................................................................7 5.1.3. Caracterizao do amido por reao de fenol cido sulfrico ......................................................7 5.1.4. Caracterizao do amido por reao com iodo .............................................................................7 5.1.5. Precipitao do amido por soluo saturada de sulfato de amnio ...............................................8 5.1.6. Precipitao do amido por lcool etlico .......................................................................................85.2. Extrao e caracterizao do glicognio heptico5.2.1. Extrao do glicognio heptico com KOH a quente ...................................................................8 5.2.2. Caracterizao Colorimtrica e Hidrlise Enzimtica do Glicognio ..........................................96. Concluso .....................................................................................................................................10 7. Bibliografia ..................................................................................................................................11Presidente Prudente, 07 de abril de 201011. INTRODUO Os principais polissacardeos encontrados na natureza so constitudos de glicose, um carboidrato, mostrado na Figura 1.1. A glicose,o glicognio e o amido que so polissacardeos estruturais das plantas, de reserva animal e reserva vegetal, respectivamente, so formados exclusivamente de glicose. A reao de fenol cido sulfrico pode ser utilizada para caracterizar a presena de glicose e carboidratos em geral. O mecanismo da reao baseia-se na formao de furfural e hidroximetil-furfural pela ao de um cido forte sobre uma pentose e hexose, respectivamenteFigura 1.1 Molcula de GlicoseO amido, um composto grande e complexo, considerado a principal reserva das plantas armazenado nas clulas do parnquima amilfero(tecido vegetal presente nos tubrculos com clulas armazenadoras de amido) de caules (batatinha) e razes (mandioca) e de muitas algas. Dentro das clulas encontram-se na forma de dois principais grnulos: a amilose e amilopectina, polissacardeos que diferem na estrutura molecular. Apresentam-se como ps finos de colorao esbranquiada, formas e estratificaes variveis. A molcula de amilose no apresenta ramificaes e, no espao, apresenta estrutura helicoidal. J a amilopectina, possui uma estrutura ramificada, sendo que os ligantes aparecem a cada 24-30 molculas de glicose; a ligao entre as unidades de glicose do tipo alfa 1-4 na mesma cadeia, porm, unindo as cadeias aparece as ligaes do tipo 1-6. O gro de amido constitudo de hilo (ponto inicial de formao) e lamelas ou estrias (zonas claras e escuras). Na anlise microscpica devem ser observadas caractersticas como a forma (esfricos, ovides, polidricos, periformes, elipsides etc.), presena de lamelas, tipo de hilo (pontuado, estrelado, linear etc.) e estado de agregao.Presidente Prudente, 07 de abril de 20102Figura 1.2 Estrutura do AmidoPara caracterizar a presena de amido em algum material basta adicionar iodo, pois coramse de azul-arroxeado frente ao iodo, pelo fato deste halognio formar um complexo com os polissacardeos, principalmente amilose. Por este motivo, utiliza-se como corante de identificao a glicerina iodada ou o lugol. Quando tratados por gua aquecida, entumecem. So solveis em soluo aquosa de cloral hidratado. So refringentes e apresentam uma cruz negra de braos recurvos (cruz de Malta) quando observados luz polarizada. J o glicognio, um polissacardeo de reserva nas clulas animais, possui uma estrutura mais compacta e ramificada do que o amido. Aparece em abundncia no fgado (at 10% do peso efetivo) e tambm compe significativamente o msculo esqueltico (1 a 2%). Nos hepatcitos o glicognio aparece como grandes agregados moleculares, grnulos ou rosetas, formados por grnulos menores. O glicognio constitu-se de uma molcula ramificada formada por unidades de glicose em ligao glicosdica 1-4, com ramificao onde a ligao 1-6. Vale lembrar que a quantidade ligao 1-6 mais presente no glicognio, o que confere o alto grau de ramificao da molcula. Esse metabolizvel por dois tipos de enzimas: a fosforilase (produzindo glucose-1-fosfato) e as amilases (alfa, beta, amiloglucosidase, isoamilase, etc.), estas produzindo glucose ou oligmeros. Pode ser isolado dos tecidos por meio de digesto a quente , com soluo concentrada de lcalis fortes ou a frio com soluo de cloreto de mercrio. Em ambos os mtodos so preservadas as ligaes de glicosdicas no redutoras alfa 1-4 e alfa 1-6. O glicognio susceptvel hidrlise enzimtica pelas alfa amilases, como por exemplo, a salivar. A exemplo da amilose, ele tambm se complexa com o iodo, embora o faa com menor intensidade que os dois componentes do amido. Como a reatividade do iodo depende dos segmentos lineares com ligaes alfa 1-4 cada passo de hlice com 6 resduos glucosil oclue um tomo de I 2 e h formao de cor. A intensidade da reao com iodo d-se na seguinte ordem decrescente: amilose, amilopectina, glicognio; e as cores formadas so respectivamente: azul intenso, violceo avinhado e castanho. O tratamento desses polissacardeos com alfa amilases, especficas para a hidrlise das ligaes glicosdicas alfa 1-4, suprime ento esta reatividade frente ao iodo.Presidente Prudente, 07 de abril de 2010 32. OBJETIVO a) Demonstrar a extrao e caracterizao de polissacardeos de materiais biolgicos: amido de batata e glicognio de fgado; b) identificar o amido e o glicognio como carboidratos; c) evidenciar o amido e o glicognio atravs de reaes de colorao e precipitao. 3. MATERIAIS 3.1. Reaes de caracterizao do amido a) Soluo de amido recm-preparada; b) cido sulfrico concentrado; c) soluo de fenol 5%; d) soluo de lugol; e) soluo saturada de sulfato de amnio; f) lcool etlico absoluto. g) bquer 250mL; h) erlernmeyer de 125mL; i) filtro de papel. 3.2.Extrao do glicognio heptico Alm dos materiais j citados, necessita-se de: a) 5g de fgado fresco de boi; b) soluo de KOH 5M; c) etanol gelado; d) centrfuga com frequncia de pelo menos 3000 r.p.m; e) saliva (mistura de 2 ou 3 doadores) diluida 1:10 com soluo de NaCl 5mM. f) reativo do iodo.Presidente Prudente, 07 de abril de 201044. METODOLOGIA 4.1. Extrao e caracterizao do amido da batata 4.1.1. Extrao do amido Raspar um pedao de batata, transferir a raspa para um bquer de 250mL. Adicionar 100mL de gua destilada e agitar com um basto de vidro. Filtrar e recolher o lquido num erlernmeyer de 125mL. Deixar o amido depositar no fundo do enlernmeyer durante 10 minutos e, a segui, remover cuidadosamente o lquido sobrenadante para descart-lo. O que sobra no erlernmeyer um depsito de amido. 4.1.2. Preparo de uma soluo de amido Manter aproximadamente 150mL de gua fervendo em um bquer de 250mL. Acrescentar aproximadamente 50mL de gua fria ao depsito de gros de amido obtido anteriormente e adicionar esta suspenso de amido lentamente e com constante agitao, gua fervente. Continuar o aquecimento at que se forme uma soluo leitosa e azulada. 4.1.3. Caracterizao do amido por reao de fenol cido sulfrico Em um tubo de ensaio pipetar 0,5 ml de soluo de amido (diluda previamente de 1:10), ou seja, adicionar 4,5ml de gua destilada. Desta soluo coletar 0,5ml e colocar num segundo tubo, juntar a este 0,5ml de soluo de fenol 5% e adicionar 2,5ml de cido sulfrico concentrado, nun nico jato. Observar a cor laranja caracterstica da reao. 4.1.4. Caracterizao do amido por reao com iodo Em um tubo de ensaio pipetar 2ml de soluo de amido e adicionar 2 gotas de lugol. Notar o aparecimento de cor azul intensa. Aquecer. Observar. Resfriar o tubo em gua corrente. Observar. 4.1.5. Precipitao do amido por soluo saturada de sulfato de amnio A 5ml de soluo de amido adicionar 5ml de soluo saturada de sulfato de amnio. Agitar fortemente e deixar em repouso por 10minutos. Filtrar. Pesquisar, separadamente, no filtrado e no precipitado, a presena de amido pelo teste do iodo, adicionando 2 gotas de lugol ao precipitado e tambm no sobrenadante. 4.1.6. Precipitao do amido por lcool etlico A 2ml de soluo de amido adicionar 5ml de lcool etlico. Agitar. Filtrar e pesquisar amidoPresidente Prudente, 07 de abril de 2010 5como na experiencia anterior, tanto no filtrado, como no precipitado. 4.2. Extrao e caracterizao do glicognio heptico 4.2.1. Extrao do glicognio heptico com KOH a quente Colocar 5g de fgado em um tubo de ensaio com 15mL de KOH 5M. Aquecer em banho maria, agitando at a dissoluo do tecido, aproximadamente 15 minutos. Ao esfriar a mistura, deve-se despej-la lentamente em um erlernmeyer com 40 mL de etanol gelado. 4.2.2. Caracterizao Colorimtrica e Hidrlise Enzimtica do Glicognio Inicialmente so numerados seis tubos de ensaio. No tubo 1 h somente 0,4mL de gua destilada; o tubo 2 contm 0,3mL de gua destilada e 0,1mL de saliva diluda 1:10 com NaCl 5mM; o tubo 3 apresenta 0,3mL de gua destilada e 0,1mg/mL de glicognio enquanto que o tubo 4 contm 0,1mL daquela e 0,3mg/mL deste. J no tubo 5 foi adicionado 0,2mL de gua destilada, 0,1mg/mL de glicognio e 0,1mL de saliva diluda 1:10 com NaCl 5mM. Por fim, no tubo 6, encontra-se apenas 0,3mg/mL de glicognio e 0,1mL da saliva. Os tubos de ensaio, ento, ficam incubados temperatura ambiente por aproximadamente 10minutos, com agitao dos tubos 5 e 6 ocasionalmente. E, aps o tempo de incubao, adicionado 1,6mL de reativo de iodo a comear pelos tubos 5 e 6 seguido da agitao dos tubos.Presidente Prudente, 07 de abril de 201065. RESULTADOS E DISCUSSO 5.1. Extrao e caracterizao do amido da batata 5.1.1. Extrao do amido Ao raspar a batata com uma faca h o rompimento das clulas que a compem, dentro dessas clulas h presena de amiloplastos, onde esto contidos os grnulos de amido (amilopectina e amilose). Com o rompimento das clulas os amiloplastos so liberados para o meio, que no caso do experimento composto por 100ml de gua, solubilizando-se. A agitao com o basto de vidro feita para influenciar ainda mais a liberao dos amiloplastos das clulas da batata. Filtra a soluo obtida e espera o amido precipitar para retirar o sobrenadante e obter uma maior concentrao de amido na soluo. 5.1.2. Preparo de uma soluo de amido No preparo da soluo de amido adicionou-se agua fria ao depsito de amido obtido na reao anterior para que depois essa soluo resultante pudesse ser adicionada gua quente fazendo com que os amiloplastos se rompessem, liberando a amilose e a amino-pectina para o meio. A amostra obtida uma soluo esbranquiada onde h a presena dos amidos citados anteriormente permite a realizao de reaes de caracterizao desse polissacardio. 5.1.3. Caracterizao do amido por reao de fenol cido sulfrico Aps misturar as solues de amido diluda, a soluo de fenol 5% e do cido sulfrico, forma-se no tubo uma soluo de cor laranja, caracterizando assim a presena de amido na amostra. Isso ocorre pelo fato de um cido forte, no caso o cido sulfrico, agir sobre a hexose, amido, hidrolisando-o e liberando molculas de glucose que forma um composto chamado hidroximetilfurfural. Esse ultimo composto reage com o fenol formando o produto de colorao laranja citado acima. 5.1.4. Caracterizao do amido por reao com iodo Aps a adio de lugol na soluo de amido bem visvel a colorao azul-escuro que se forma no tubo, porm quando este aquecido essa soluo passa a ter uma colorao amarelada translucida. A soluo de amido fica azul-escura na presena de lugol, devido aquela formar um complexo colorido com o iodo presente neste. Sendo que a amilose d origem a uma colorao negro-azulada, enquanto a amilopectina d origem a uma colorao vermelho-violcea, o que no nos deixa concluir que a amilose encontrava-se em maior quantidade na soluo do que aPresidente Prudente, 07 de abril de 2010 7amilopectina devido ao predomnio da colorao azul-escuro. J que aquela, devido as suas cadeias lineares apresenta uma conformao helicoidal capaz de ocluir o iodo, o que no ocorre com a amilopectina onde a formao de hlice fica em parte dificultada pelos pontos de ramificao da molcula. Ao aquecer a soluo de amido e lugol esse complexo se dissocia, formando uma soluo amarelo-laranjada devido a presena de iodo dissociado que proporciona essa cor caracterstica. 5.1.5. Precipitao do amido por soluo saturada de sulfato de amnio Depois de 10 minutos de repouso, observa-se a formao de um precipitado no fundo do tubo, sendo este de colorao branca e aspecto viscoso. Ele ocorre devido a adio de sulfato de amnio na soluo de amido. Pois assim como as protenas, o amido se solubiliza na gua devido a presena de pontes de hidrognio, o sulfato de amnio, sendo um sal muito solvel, aumenta a fora inica desidratando o amido sendo que este precipita. Porm, aps filtrar o precipitado e adicionar o lugol neste e na soluo filtrada observa-se que a cor do tubo que a possui azul translucida, mostrando que h a possibilidade de nem todo o amido ter se precipitado, levando-se em considerao a reao de caracterizao com iodo, citada acima. O precipitado, como esperado, apresenta um colorao azul-preta, por ser composto essencialmente de amido. 5.1.6. Precipitao do amido por lcool etlico Neste experimento tambm forma-se um precipitado com as mesmas caractersticas do precipitado descrito acima. S que neste caso, a precipitao ocorre devido a adio de lcool etlico na soluo de amido. O etanol um solvente orgnico, possui grande solubilidade na gua, assim, quando adicionado soluo de amido ele se solubiliza rompendo as interaes amido-gua fazendo com que este se precipite. Aps filtrar-se a amostra, adiciona-se lugol tanto ao precipitado quanto a soluo filtrada. Observa-se nesse ponto, uma diferena entre a soluo filtrada desse experimento com a do anterior, a colorao do tubo fica amarelo-laranjado devido ao iodo do lugol, pressupondo-se assim, que no h presena de amido nela, o que no ocorreu no filtrado anterior. O precipitado, como esperado, adquiri cor azul-preta, por ser formado essencialmente de amido. 5.2. Extrao e caracterizao do glicognio heptico 5.2.1. Extrao do Glicognio Heptico Aps a dissoluo do tecido animal e com a adio de etanol gelado evitando assim, sua vaporizao, j que tal composto voltil temperatura ambiente ocorre a precipitao do tecidoPresidente Prudente, 07 de abril de 2010 8na forma de flocos, isto porque o lcool etlico forma pontes de hidrognio com a gua, impedindo a ligao desta com o glicognio, o qual precipita-se. Com a centrifugao dos seis tubos de ensaio, obtm-se um lquido sobrenadante e uma pequena poro marrom escuro de precipitado. Aps a retirada de tal lquido e a adio de gua destilada (no total, 3mL), foi possvel notar a formao de espuma. A formao de espuma ocorre devido presena de KOH, lipdios e protenas de membrana. Finalmente, depois de centrifugar e, em seguida, dissolver novamente (10mL de gua destilada) o precipitado, obtm-se uma soluo opalescente e que contm glicognio. 5.2.2. Caracterizao Colorimtrica e Hidrlise Enzimtica do Glicognio Os tubos 1 e 2, ambos contendo gua destilada, e a saliva no segundo, adquirem colorao amarelada devido presena do iodo. J os tubos 3 e 4, contendo apenas gua destilada e glicognio, apresentam colorao levemente castanho, sendo que esta d-se mais intensamente no tubo 4, visto que h maior concentrao de glicognio, comprovando assim que esta tcnica colorimtrica pode ser aplicada quantitativamente, isto , existe correspondncia linear entre a concentrao de glicognio e a densidade tica. Os tubos 5 e 6 so os nicos que contm saliva (amilase salivar) e glicognio simultaneamente. Alm disso, h gua no tubo 5, da a hidrlise do glicognio neste ser um pouco maior em relao ao tubo 6, pelo qual iniciou-se a adio de reativo de iodo. Comparando os tubos 3 e 5, os quais contm a mesma quantidade de glicognio (0,1mg/mL), pode-se notar que o primeiro apresenta colorao castanho mais intensa, devido ausncia da amilase salivar, a qual auxilia o processo de degradao do glicognio. A partir da anlise dos tubos 4 e 6 ambos contendo 0,3mg/mL de glicognio verifica-se diferenas na colorao de suas amostras. No tubo 4, ocorre a hidrlise total do glicognio, enquanto que no tubo 6, sem gua destilada, h hidrlise parcial do glicognio pela ao da amilase salivar. importante destacar que a diluio da saliva apenas com cloreto de sdio justifica-se por ser o nion Cl um excelente ativador da amilase salivar. A presena de tampo dispensvel, pois a amilase salivar apresenta ampla faixa de pH timo (de 5 at 8) e a incluso do habitual tampo fosfato pH 7,0 geraria uma incompatibilidade com a presena de cor (CaCl2).Presidente Prudente, 07 de abril de 201096.CONCLUSO Durante os experimentos trabalhou-se com dois tipos diferentes de polissacardio, um de origem vegetal, o amido, e outro de origem animal, o glicognio. Na extrao destes das suas respectivas clulas, pode-se notar uma grande diferena: a complexidade para extrair glicognio das clulas do fgado comparado extrao do amido das clulas da batata. Isso ocorre devido a diferena de estrutura molecular entres esses carboidratos, sendo aquele altamente ramificado. Na execuo das reaes de colorao para a caracterizao dos carboidratos percebe-se que os compostos contendo iodo, so convenientes identificao, tanto a do amido, composto por amilose e amilopectina, quanto a do glicognio. Na precipitao dos dois diferentes carboidratos percebe-se uma maior complexidade para trabalhar com o polissacardeo glicognio. Sendo necessrio leva-lo a uma centrifugadora para que se pudesse precipita-lo com o auxlio de um mtodo fsico, o mesmo no ocorre com o amido que precipitado apenas com a adio de determinadas substncia, destacando-se o lcool etlico, utilizado na precipitao dos dois. Essa diferena ocorre pelo mesmo motivo da complexidade de extrao do glicognio comparado com o amido, j que aquele contem uma estrutura molecular muito mais complexa que este.Presidente Prudente, 07 de abril de 2010107. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS LEHNINGER, ALBERT LESTER. Princpios de bioqumica. 4 edio. So Paulo: SARVIER, 2006. MARZZOCO, ANITA & TORRES, BAYARDO B. Bioqumica Bsica. 3 edio. Rio de Janeiro: GUANABARA KOOGAN, 2007. Teste do amido. . Acessado em: 05 de abril de 2010.Presidente Prudente, 07 de abril de 201011