Electroforesis y Visualizacin Del Adn Sil y Ges

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    13-Oct-2015

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ELECTROFORESIS Y VISUALIZACIN DEL ADNResumenLa electroforesis es una tcnica til para la separacin de molculas en una mezcla, mediante la aplicacin de un campo elctrico; basndose en una relacin de desplazamiento carga:masa nica en cada molcula disuelta. (5). Esta tcnica tiene mltiples funciones cuantitativas y de identificacin necesarias en estudios experimentales y complementarias en diferentes tcnicas de la biologa general. En esta prctica se realiz una electroforesis con ADN bacteriano de Echerichia coli en un medio de agarosa al 0.8%.

Introduccin La electroforesis es una tcnica que ayuda en el estudio del movimiento de las biomolculas con una carga neta a travs de un campo elctrico. Su migracin depende de la forma, tamao, carga y composicin qumica; es decir, en una mezcla cada molcula presenta una carga y tamao nicos, por lo tanto la movilidad y la velocidad de migracin en el campo elctrico para cada molcula es tambin nica y separable en bandas (6).La electroforesis es una tcnica que se utiliza para analizar y determinar el peso molecular de diferentes tipos de biomolculas, siendo ms comn su uso en protenas y cidos nucledos (6). Existen diferentes tipos de electroforesis cuya diferencia radica en los distintos tipos de desplazamiento; en la electroforesis de frente mvil, las partculas se mueven de forma libre en el medio en que se encuentran dispersas y en la electroforesis de zonal, la muestra esta obligada a desplazarse sobre un mecanismo o soporte solido que puede ser restrictivo (geles de almidn y poliacrilamida) o no restrictivo (papel, acetato celulosa y agarosa) (4). Los geles de celulosa de soporte solido, son usados para molculas de bajo peso molecular como los aminocidos y los carbohidratos; en cambio los geles de poliacrilamida y agarosa de matriz porosa, se utilizan para molculas de mayor peso molecular (DNA, RNA y protenas) (6).La electroforesis en gel de agarosa es un mtodo bastante utilizado para separar, identificar y purificar fragmentos de ADN, que han sido extrados anteriormente. La agarosa es un polmero lineal, extrado de algas marinas y no toxico. Los geles de agarosa se preparan fundiendo agarosa en presencia del buffer adecuado hasta que se logre una solucin transparente. La solucin fundida es puesta en un molde donde gelifica. El gel forma una matriz cuya densidad est determinada por la concentracin de agarosa. Cuando se aplica un campo elctrico a travs del gel, el ADN migra hacia el nodo. Entre los factores que afectan la velocidad en la tasa de migracin del ADN en los geles de agarosa se incluyen: el tamao del fragmento a migrar (ADN), la concentracin de agarosa, la conformacin de ADN, el voltaje aplicado y el amortiguador utilizado. (1)El buffer de corrida es utilizado para baar el gel de agarosa Y puede ser reciclado y utilizado varias veces para este procedimiento. Los ms comnmente usados son TBE (Tris-Borato-EDTA) y TAE (Tris-Acetato-EDTA); aunque es ms frecuente el uso de TAE, este presenta capacidad de buffer ms baja que el TBE. El TBE puede ser usado para electroforesis de DNA de bajo peso molecular y en los sistemas en los cuales es usado no requiere de sistemas adicionales de recircularizacin. El buffer de carga (pH 7), son adicionados a las muestras antes de servir en el gel con el propsito de incrementar la densidad de la muestra; asegurando que el ADN precipite al fondo de los pozos y adicionando color a la muestra mediante colorantes indicadores o agentes intercalantes (BPB o FF, entre otros) que permiten el seguimiento de la electroforesis; dada la co-migracin de los colorantes indicadores con fragmentos de DNA de tamao especfico (7). EZ -Vision es un agente intercalante de reaccin fluorescente no mutagnico, no toxico, ni peligroso en su manipulacin, transporte y eliminacin; a comparacin del ms usado Bromuro de etidio. Principalmente forma un apretado complejo con el ADN de la muestra y co- migra con l durante la electroforesis; proporcionando la visualizacin instantnea de sus bandas tras la iluminacin UV de geles de agarosa. (8)

Materiales y Mtodos

Para la prctica se requiri de los siguientes Instrumentos, materiales moleculares y reactivos qumicos:

Instrumentos: Micropipeta, termociclador, microtubos, cmara electrofortica, fotodocumentador, horno microondas y pelculas de ParaFilm.

Material molecular: ADN genmico de Echerichia coli, plsmido recombinante, plsmido no recombinante y una PCR.

Reactivos: Buffer TBE (carga y corrida) 0.5X, Agarosa (0.8%) y EZ-Vision.

1. Se fundieron 30 mL (0.24 gr) de Agarosa al 0.8%, anteriormente gelificada. Se emplearon 6 ciclos de calor, cada uno de 8 segundos aproximadamente; utilizando la energa calrica de un horno microondas. Se verific que la Agarosa tuviera una contextura liquida, clara y muy homognea.

2. Se verti la solucin de agarosa en la caja molde electrofortica, verificando que no existiera ninguna burbuja y se coloc el peine con las cabezas de los tornillos hacia el frente, cerrndolo hermticamente en las extremidades.

3. Se espero unos segundos y se introdujo la Agarosa a una nevera para gelificar la solucin. Transcurrido 10 minutos se observ que faltaba un poco y se espero otros 5 minutos ms.

4. Al enfriar y gelificar completamente la Agarosa; se sac el peine y los cauchos del gel, se ensamblo el molde en la cmara y se sumergi el gel en una solucin de buffer de corrida 0.5X TBE; cubriendo 3 milmetros por encima a los posos credos por los peines.

5. Se utiliz una micropipeta de 10x para premezclar el buffer de carga 0.5X (TBE) + el EZ-Vision = equivalentes a 1.4 L que se colocaron en una pelcula de ParaFilm formando una gota o punto. Se repiti 4 veces ms este procedimiento.

6. Al terminar de premezclar y colocar las cinco gotas; a cada una se le adicion su correspondiente muestra.

# gota Muestra

11L del marcador de peso molecular

23L de ADN genmico de E.coli

33L de PCR

43L de Plsmido no recombinante

53L de Plsmido recombinante

7. Se Tom con la punta de la micropipeta (10X), la primera muestra (gota # 1), para empozarla en el fondo del primer poso; procurando no romper el gel y se descarg suavemente la muestra. Se repiti este procedimiento con las 4 muestras faltantes, siguiendo una lnea horizontal y una seguida de otra.

8. Se encendi la fuente de poder y se corri el gel a 120V/cm * 30 minutos hasta que los indicadores migraron la distancia apropiada

9. Se visualiz el ADN bajo la lmpara UV y se tomo una foto de la imagen.

10. Se descarg el Software Gelanalyzer(R) para analizar los datos de la imagen

Planteamientos de conclusiones

Las molculas de ADN de doble cadena migran de manera inversamente proporcional al logaritmo en base 10 (log 10) de sus tamaos moleculares y dado que el ADN esta cargado negativamente debido a sus grupos fosfatos de la molcula la migracin en la cmara de electroforesis ocurre del polo negativo hacia el polo positivo.(1)Un fragmento de ADN lineal migra a diferentes velocidades dentro de geles con diferentes concentraciones de agarosa. Existiendo una relacin lineal entre el logaritmo de la movilidad electrofortica del ADN y la concentracin del gel de agarosa; es decir, a mayor concentracin menor rango de separacin (2)Las molculas circulares y las lineales presentan diferencias en su migracin a travs de la matriz agarosa; es as como las formas circulares plegadas migran mas rpido que las formas circulares con rompimientos de enlace fosfodiester en una de las cadenas y que las formas lineales (1).La migracin de ADN se ve afectado por la composicin como la fuerza inica del amortiguador empleado.de manera que se debe establecer un balance de iones que genere una fuerza inica suficiente para lograr la conductancia elctrica, sin excederse y ocasionar un calentamiento excesivo con fusin de la agarosa y desnaturalizacin de ADN.(1)El colorante se intercala entre las bases del ADN de manera que el colorante unido unido al mismo presenta una mayor fluorescencia que el colorante solo en solucin. A 254nm la radiacin UV es absorbida por el ADN y TRANSMITIDA AL COLORANTE, pero a 302 y 366 nm es absorbida nicamente por el colorante unido al ADN. En ambos casos, la energa es re-emitida a 590 nm en la regin rojo-naranja del espectro visible. (1)El voltaje bajo la migracin de las molculas lineales de ADN es proporcional al voltaje aplicado. Por lo tanto el rango de separacin efectiva en los geles de agarosa decrece cuando se eleva el voltaje aplicado. (1)

Bibliografas 1. Puerta B. Concepcin y Urea P. Claudia. Prcticas de biologa molecular. Ed Pontificia Universidad Javeriana. Colombia 2005.pg 24-28

2. Sambrook, J. y Russell, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3 ed. Ed Cold Spring Harbor Laboratories. Nueva York. USA 2001. Pgs. 23-44.

3. DAVID L. NELSON;MICHAEL M. COX. Lehninger Principios de bioqumica. Cuarta Edicin. Ed Omega. 2006. Pg. 86-87

4. Christopher K. Mathews Kensal E. van Holde Kevin G. Ahern. Bioqumica. Tercera edicin. Ed PEARSON EDUCACION S.A. Madrid. Espaa 2002.pg 1040.

5. Lodish, Berk. Matsudaira, Kaiser y otros. Biologa celular y molecular. Ed. Mdica Panamericana. 5 ed.Capitulo 3.6. Buenos Aires. Argentina 2005. Pg. 87

6. Segal Kischinevzky,Claudia Andrea. Manual de Practicas Biologa Molecular de la Celula L. Ed UNAM. Universidad Nacional Autnoma de Mxico. Facultad de Ciencias. Colombia 2005. Pg. 51-56

7. Serna Oriana. ELECTROFORESIS Y VISUALIZACIN DEL ADN. Laboratorio de biologa molecular (20071). UNIVERSIDAD INDUSTRIAL DE SANTANDER. 2013

8. EZ-VisionA Fluorescent Dye for the Instant Visualization of DNA Bands in Agarose Gels Supplied in 6X Loading Buffer. 1-800-829-2805 web http://www.amresco-inc.com/media.acux/eef4bdfc-0b74-4f46-8e9c-fb48bebdc6d3