Aplicao de anlise multivariada aos dados de anlise ...

  • Published on
    08-Jan-2017

  • View
    228

  • Download
    9

Transcript

  • Alexandre Ataide da Silva

    Aplicao de anlise multivariada aos dados de anlise cromatogrfica e espectroscopia para a diferenciao de extratos de madeira.

    So Carlos 2012

    Tese apresentada ao Instituto de Qumica de So Carlos da Universidade de So Paulo para obteno do ttulo de doutor em cincias. rea de concentrao: Qumica Anlitica Orientador: Prof. Dr Douglas Wagner Franco

  • Agradecimentos

    DEDICATRIA

    Aos meus pais Eliseu e Leontina, meu irmo Henrique e minha sobrinha Letcia, que estiveram sempre comigo e so

    os maiores incentivadores e razo desta luta. A Carina, pelo amor, carinho e companheirismo ao longo deste trabalho.

    A minha pequena sobrinha e afilhada Izabel Arlete (in memoriam).

  • Agradecimentos

    AGRADECIMENTOS

    Agradeo primeiramente a Deus por sempre me socorrer nos momentos difceis e me

    dar paz para aproveitar os bons momentos.

    A Carina, pela sua dedicao, amor, compreenso, amvel companhia e ajuda na

    formatao desta tese.

    Aos meus enteados, Pedro e Murilo, meninos maravilhosos e queridos.

    A minha cunhada Camila, pela amizade e bons momentos nas reunies familiares.

    Aos amigos do LDQA que me acompanharam nesta jornada: Carlos Cajuru,

    Eduardo, Wendel, Felipo, Andr Barbie, Aline, Silmara, Regina, Ana Claudia, Pedro (Peter

    coiote), Silvia, Natalia, Ivonete, Ticiane, Thiago Papa, Barbie, Tiago (Yudi), Leandro Boizo

    e Line.

    Aos amigos do Laboratrio de Inorgnica, Antonio Nana, Maycon, Gustavo Barba,

    Daniela, Aline Tavares e Thiago.

    Ao Professor Douglas, pela orientao ao longo destes anos, pelos conselhos

    pessoais e profissionais e amizade.

    Ao Prof. Dr. Daniel Rodrigues pela estimada amizade.

    Aos amigos Willian Diamond e famlia, Flvio baixinho, Pedro (Baiano), Carol,

    Mago, Petacci, Melchior, Dirlandi, Juba, Edvan, Evania, Z Luiz e tantos outros que no

    caberiam numa pgina s.

    As secretrias Veroneide, Cludia e Gisleine, Silvia (ps) e Andria (ps) por

    sempre socorrer nos momentos de aperto e pela amizade.

    E a todos que passaram pela minha vida e contriburam de alguma forma, alguns

    muitos, outros poucos, mas todos com sua importncia e sero sempre lembrados. Aos que

    no contriburam agradeo por no ter atrapalhado.

  • Epgrafe

    "Se eu conhecesse a causa da minha ignorncia, seria um sbio."

    (Kahlil Gibran)

    Trabalha como se vivesses para sempre. Ama como se fosses morrer hoje.

    (Sneca)

    H trs mtodos para ganhar sabedoria: primeiro, por reflexo, que o mais

    nobre; segundo, por imitao, que o mais fcil; e terceiro, por experincia, que

    o mais amargo.. (Confcio)

    A grandeza no consiste em receber honras, mas em merec-las (Aristteles)

  • Resumo

    i

    RESUMO

    A presena de 14 compostos fenlicos (cido elgico, cido glico, vanilina, siringaldedo,

    sinapaldedo, coniferaldedo, cido vanlico , sirngico cido, a quercetina, trans-resveratrol,

    catequina, epicatequina, eugenol, e miricetina) e duas cumarinas (escopoletina e cumarina) foi

    investigada por HPLC-ESI-MSn em um total de 25 extratos de aguardente de seis diferentes

    madeiras brasileiras e o carvalho, comumente utilizados pela indstria de tanoaria para o

    envelhecimento da cachaa. Estes dados foram comparados com os anteriormente obtidos

    utilizando HPLC-DAD-Fluorescncia. Questes pendentes relativas atribuio da

    epicatequina, co-eluies do cido glico e do cido elagico respectivamente foram

    resolvidas utilizando HPLC-ESI-MSn. Alm disso, elaborou-se uma impresso digital

    cromatogrfica de HPLC-DAD usando a anlise quimiomtrica (PCA) com base nos perfis de

    eluio cromatogrfica dos extratos monitorizada a 280 nm. As principais diferenas

    observadas entre o carvalho e as madeiras brasileiras reside nas concentraes de cumarina,

    catequina, siringaldedo, e coniferaldedo. A anlise quimiometrica do perfil do quantitativo

    dos 14 compostos fenlicos e das duas cumarinas nos extractos de madeira permitiu uma boa

    diferenciao entre os extratos das madeiras brasileiras e os extratos de carvalho. A impresso

    digital cromatogrfica analisada por PCA revelou diferenas significativas entre as madeiras

    brasileiras e o carvalho, definindo claramente seis grupos de extratos de madeira: (i) extratos

    de carvalho, extratos (ii) de jatob, (iii) cabreva- parda extratos, (iv) os extratos de

    amendoim (v) canela-sassafrs e extratos (vi) de pequi. As anlises multivariadas de UV-Vis

    de dados espectrais de 93 extratos de cachaa ,de madeiras brasileiras e de carvalho, forneceu

    um modelo simples e robusto para classificar cachaas brasileiras de acordo com as espcies

    de madeira utilizados nos barris de maturao. Aplicao de PCA (Anlise de Componentes

    Principais) e HCA (anlise hierrquica de agrupamentos) levou a identificao de 7

    agrupamentos; amburana, amendoim, balsamo, castanheira, jatob, jequitib e carvalho. A

  • Resumo

    ii

    aplicaao de LDA (Anlise Discriminante Linear) aos resultados experimentais permitiu a

    classificao de 10 diferentes espcies de madeira utilizadas nos extratos de cachaa

    ;amburana, amendoim, balsamo, cabreva-parda, canela sassafrs, castanheira, jatob,

    jequitib-rosa, louro-canela, e carvalho, com uma preciso variando de 80% (amendoim e

    Castanheira) a 100% (blsamo e jequitib-rosa). A auto consistncia do modelo foi verificada

    usando 50 amostras de cachaas comerciais. Um ndice de classificao muito bom foi

    observado para este modelo, cuja atribuiao correta variou de 100% a 80 %. A metodologia

    aqui desenvolvida (UV-vis) fornece uma alternativa de baixo custo e robusta a cromatografia

    lquida e a espectrometria de massa para identificar as diferentes espcies de madeira

    utilizadas nas construes dos barris em que destilados foram armazenados. Alm disso, ela

    contm potencial como uma possvel ferramenta forense para a identificao de madeiras

    objetivando controlar a extrao de espcies em risco. Estes desenvolvimentos poderao ser

    ampliados para outros destilados e para uma maior variedade de espcies de madeira.

  • Abstract iii

    ABSTRACT

    A total of 25 sugarcane spirit extracts of six different Brazilian woods and oak, commonly

    used by cooperage industries for aging cachaa, were analyzed for the presence of 14 phenolic

    compounds (ellagic acid, gallic acid, vanillin, syringaldehyde, synapaldehyde,

    coniferaldehyde, vanillic acid, syringic acid, quercetin, trans-resveratrol, catechin,

    epicatechin, eugenol, and myricetin) and two coumarins (scopoletin and coumarin) by HPLC-

    ESI-MSn . This data was compared with the previous one obtained from HPLC-DAD-

    Fluorescence. Pending questions regarding to epicatechin attribution, galic acid and elagic

    acid co-elution have been solved through HPLC-ESI-MSn analysis. Furthermore, an HPLC-

    DAD chromatographic fingerprint was build-up using chemometric analysis based on the

    chromatographic elution profiles of the extracts monitored at 280nm. The main difference

    observed among oak and Brazilian woods remains in the concentration of coumarin, catechin,

    syringaldehyde, and coniferaldehyde. The chemometric analysis of the quantitative profile of

    the 14 phenolic compounds and two coumarins in the wood extracts provides a good

    differentiation between the Brazilian wood and oak extracts. The chromatographic fingerprint

    treated by multivariate analysis revealed significant differences among Brazilian woods

    themselves and oak, clearly defining six groups of wood extracts: (i) oak extracts, (ii) jatob

    extracts, (iii) cabreva-parda extracts, (iv) amendoim extracts, (v) canela-sassafrs extracts

    and (vi) pequi extracts.

    Multivariate analyses of UV-Vis spectral data from 93 cachaa wood extracts provide a

    simple and robust model to classify aged Brazilian cachacas according to the wood species

    used in the maturation barrels. Application of PCA (Principal Components Analysis) and

  • Abstract iv

    HCA (Hierarchical Cluster Analysis) leads to identification of 7 clusters of cachacas wood

    extracts (amburana, amendoim, balsamo, castanheira, jatoba, jequitib and oak). LDA (Linear

    Discriminant Analysis) affords classification of 10 different wood species used in the cachaa

    extracts (amburana, amendoim, balsamo, cabreuva-parda, canela-sassafras, castanheira,

    jatob, jequitiba-rosa, louro-canela, and oak) with an accuracy ranging from 80% (amendoim

    and castanheira) to 100% (blsamo and jequitib-rosa).This model self consistency was

    checked using 50 samples of commercial cachaas. A very good classification was observed

    for this model, which 100 to 80% of correct assignment.

    The methodology provides a robust low-cost alternative to methods based on liquid

    chromatography and mass spectrometry to classify cachaas aged in barrels that are composed

    of different wood species. Furthermore, it holds some potential as a possible forensic tool for

    wood identification which could be applied to control the wood marked of endangered

    species. Our findings could be extended to other spirits and to a wider variety of wood

    species.

  • Lista de Figuras v

    LISTA DE FIGURAS

    Figura 1 Corte transversal de um tronco de madeira de carvalho, mostrando ao centro o

    cerne, matria prima para a indstria tanoeira1 ..........................................................................3

    Figura 2- Safrol (5-(2-propenil)-1,3- benzodioxole)...................................................................4

    Figura 3- Cumarina (2H-chromen-2-one)...................................................................................5

    Figura 4 Correlao entre descries objetivas de anlise sensorial da cachaa e ndice

    global de preferencia..............................................................................................................10

    Figura 5 Histograma indicando a mdia do consumo de oxignio para cada espcie. ndice

    abaixo da unidade indica um efeito antioxidante.52..................................................................16

    Figura 6 - Estrutura molecular de alguns compostos encontrados em madeiras brasileiras e

    carvalho.....................................................................................................................................18

    Figura 7- Exemplo da anlise realizada considerando caracteristicas morfologicas para

    diferenciar uma amostra de maparajuba (Manilkara bidentata ssp. Surinamensis) e uma

    amostra de maarandubinha (Manilkara paraensis) que so facilmente confundidas57...........19

    Figura 8 - Grficos de score para PCA ( PC1 x PC2) dos extratos etanlicos de madeiras

    avaliados por HPLC, a partir da anlise do fingerprint cromatogrfico (= 280 nm).............32

    Figura 9 Grfico de loading para os valores da PC1, onde se observa os picos com

    maiores valores e seus respectivos tempos de reteno............................................................33

    Figura 10 Grfico de scores (PC2 13%x PC3 10%) para os extratos etanlicos obtidos a

    partir dos cromatogramas (= 280 nm).....................................................................................35

    Figura 11 Grfico de loading para os valores da PC2, onde se observa os picos com maiores

    valores e seus respectivos tempos de reteno..........................................................................36

  • Lista de Figuras vi

    Figura 12 Grfico de loading para os valores da PC3, onde observa-se os picos com maiores

    valores e seus respectivos tempo de reteno...........................................................................37

    Figura 13 Fragmentograma do pico relativo a catequina no modo negativo ESI (-) em uma

    amostra de extrato de amendoim, nota-se os ons caracteristicos da fragmentao da catequina

    (m/z: 289, 271 e 245)................................................................................................................39

    Figura 14 Amostra de extrato de carvalho exemplificando a dificuldade de se quantificar o

    cido glico em detector espectrofotmetrico (= 280 nm) no gradiente de eluio empregado

    (vide seco 2).........................................................................................................................41

    Figura 15 Cromatograma do extrato etanlico obtido por gradiente de eluio (vide seo 2)

    em HPLC-DAD (= 280 nm) de um extrato de castanheira exemplificando a coeluio do

    pico de cido elgico com o de um composto desconhecido....................................................42

    Figura 16 Cromatograma do on extraido (on selecionado 301, modo negativo) obtido a

    partir do gradiente de eluio (vide seo 2) analisado por HPLC-ESI(-)-MSn em uma amostra

    de castanheira...........................................................................................................................43

    Figura 17 Produtos da fragmentao do pseudo-on molecular [M-H]- para o pico extraido

    referente ao cido elgico operando no modo negativo (ESI(-))..............................................44

    Figura 18 Espectro de massas obtido para uma amostra de carvalho via insero direta......47

    Figura 19 Grfico de scores gerados a partir do fragmentos gerados por ionizao por

    eletrospray via insero direta dos extratos etanlicos de madeiras.....................................48

    Figura 20 Grfico de scores obtido a partir dos valores de absorbncia dos espectro eletronicos na regio do UV-vis (220-400 nm)........................................................................52

    Figura 21 Grfico de loading gerado a partir dos valores de absorbncia para os espectros

    eletronicos das amostras de madeiras medidas entre 220-400 nm............................................53

    Figura 22 Exemplos dos espectros eletrnicos caracteristicos de alguns extratos de madeiras

    analisados..................................................................................................................................55

  • Lista de Figuras vii

    Figura 23 Valores da primeira derivada aplicada aos espectros eletrnicos da Figura xx....55

    Figura 24 Grfico de scores visualizados na PC1 vs PC2 para os extratos de madeiras

    obtidos a partir dos espectro eletronicos na faixa de 220-400 nm............................................57

    Figura 25 Grfico de scores visualizados na PC1 vs PC3 para os extratos de madeiras

    obtidos a partir dos espectro eletronicos na faixa de 220-400 nm............................................57

    Figura 26 Grfico de loading (PC1 vs PC2) para os dados espectrais dos extratos de madeiras obtidos no intervalo de 220-400 nm..........................................................................59 Figura 27 - Dendrograma obtido a partir da anlise hierarquica de cluster para os extratos de

    sete tipo de madeiras (carvalho, amendoim, amburana, blsamo, jatob, jequetib e

    castanheira)...............................................................................................................................60

  • Lista de Esquemas viii

    LISTA DE ESQUEMAS

    Esquema 1 Reao do cido actico com etanol gerando acetato de etila durante o processo

    de maturao.............................................................................................................................13

    Esquema 2 Reao da acroleina durante o perodo de maturao (Cornell, 1997)................13

    Esquema 3 Seqncia de reaes de para converso de compostos fenlicos relacionados

    lignina durante o processo de estocagem em tonis de madeira, onde Ki e ki (i= 1,2,3...) so

    constantes de velocidade especifica para as reaes de converso Nishimura,

    1998).........................................................................................................................................14

    Esquema 4 - principais etapas envolvidas no processo de peroxidao lipdica (LH- .cido

    graxo polinsaturado; OH ou LO- radical alcoxila; L -radical lipdico;LOO - radical

    peroxila)....................................................................................................................................15

  • Lista de Tabelas ix

    LISTA DE TABELAS

    Tabela 1 - Parametros utilizados no espesctrometro de massas................................................29

    Tabela 2 - Principais fragmentos para os picos identificados, m/z para os pseudos ons-moleculares nos modos negativos (ESI(-)) e positivos (ESI (+), max para cada compostos e as espcies de madeiras onde estes compostos foram identificados.............................................45

    Tabela 3 - Principais ons selecionados para anlise multivariada...........................................50

    Tabela 4 Resultados obtidos para a classificao dos extratos de madeiras para os modelos de calibrao e validao (validao cruzada).........................................................................62 Tabela 5 Validao-cruzada para classificao de cachaas comerciais envelhecidas em diferentes tipos de madeiras......................................................................................................63

  • Sumrio x

    SUMRIO

    1.INTRODUO.....................................................................................................................02

    2.OBJETIVO.............................................................................................................................22

    3. MATERIAIS E MTODOS.................................................................................................23

    3.1 Reagentes............................................................................................................................23

    3.2 Amostras de madeiras.........................................................................................................23 3.3 Preparo dos extratos............................................................................................................24

    3.4 Espectros eletrnicos (UV-vis)...........................................................................................24

    3.5 Condies Cromatogrfico.................................................................................................25

    3.6 Anlise dos fragmentogramas via insero direta...............................................................25 3.7 Anlise multivariada...........................................................................................................26

    3.7.1 Tratamento dos dados espectrais......................................................................................26

    3.7.2 Tratamento dos dados cromatogrficos...........................................................................28

    3.7.3 Anlise cromatogrfica acoplada a espectrometria de massas (HPLC-ESI-MSn)...........28

    4. RESULTADOS E DISCUSSO..........................................................................................31

    4.1. Anlise multivariada aplicada aos cromatogramas obtidos HPLC-DAD (280 nm).........31

    4.2 Identificao cromatogrfica..............................................................................................38

    4.3 Fingerprint de Espectrometria de massas por ionizao por eletrospray.......................46

    4.4. Analise multivariada aplicada ao espectro eletrnico na regio do UV-vis......................51

    5. CONSIDERAES FINAIS................................................................................................66

    6. REFRENCIAS............................................................................................... 70

    ANEXO I........................................................................................................................................................... 79

  • Introduo

    1

    1.INTRODUO

  • Introduo

    2

    1. INTRODUO

    A armazenagem de bebidas em tonis de madeira extensamente empregado devido

    as caractersticas sensoriais positivas conferidas as bebidas pelo envelhecimento. Embora a

    qualidade sensorial da bebida possa ser afetada pela a gua empregada, pelo processo

    fermentativo, pelo material de origem, pelo formato do destilador, o material empregado na

    construo do tonl, e demais fatores que envolvem a cadeia de produo, o envelhecimento

    ainda considerado por muitos, como a lapidao da bebida.1

    Envolto em muita mstica sobre sua origem, o uso de nforas se remete ao antigo

    Egito. Entretanto acredita-se que no sculo XIX, os escocses ainda consumiam uisque no

    envelhecido.2

    Morfologicamente, o cerne da madeira o material de partida para a confeco dos

    tonis. O cerne, palavra que tem a mesma origem etimolgica que ncleo, a designao

    dada parte do xilema do tronco que j no mais participa ativamente na conduo de gua,

    assumindo assim uma funo essencialmente de suporte mecnico da estrutura da planta

    (Figura 1). A madeira do carvalho (Quercus sp) apresenta uma estrutura que beneficia a

    manufatura de tonis (raias medulares, teores de tilose, porosidade), caracteristicas estas

    detalhadas em varios trabalhos3. Durante o armazenamento para um tonel de carvalho

    observa-se em mdia a perda de 10% do volume do destilado por ano. Durante o perdo de

    estocagem pode se perder mais gua ou lcool, dependendo das condies de armazenamento

    da bebida (umidade e temperatura do local)3. O volume perdido durante o envelhecimento

    conhecido internacionalemnte como the angels' share (parte dos anjos), o que no Brasil

    poderia ser entendido como parte do santo.4

  • Introduo

    3

    Figura 1- Corte transversal de um tronco de madeira de carvalho, mostrando ao centro o cerne, matria prima para a indstria tanoeira1.

    Em pases onde o carvalho abundante o uso de tonis virgens ainda praticado. Este

    o caso dos Estados Unidos da Amrica do Norte, que dispe de uma grande reserva de

    carvalho branco (Quercus alba). Pases como a Esccia, onde este recurso limitado, e a

    explorao encontra-se em declinio5, a reutilizao de tonis provenientes do envelhecimento

    de sherry (vinho fortificado de uvas brancas) e de brandy (destilado de uva) tornou-se

    comum1,6. No Brasil, onde a prtica de envelhecimento de bebidas ainda se encontra em

    processo de implantao, frequente a reutilizao de tonis de carvalho provenientes do

    exterior e previamente j utilizados em outros processos de maturao de bebidas, tais como

    usque escocs.

    O controle sobre a qualidade de aquisio destes tonis e a sua reutilizao no Brasil

    ainda no foi disciplinado. Uma crescente, porm ainda pouco estudada vertente esta se

    desenvolvendo de modo emprico no pas. Trata-se do emprego de madeiras nativas para a

  • Introduo

    4

    confeco de tonis. Este processo em muitos casos faz uso do conhecimento popular, e de

    tradies passadas de gerao para gerao.7,8

    Dentre as madeiras brasileiras empregadas nas tanoarias nacionais, destacam-se o

    jatob (Hymenaea courbaril), o amendoim (Pterogyne sp.), o jequitib (Cariniana sp), a

    cabreva parda (Myrocarpus frondosus), a amburana (Amburana Cearensis), a castanheira

    (Bertholletia excelsa), a grpia (Apuleia Leiocarpa), o blsamo (Myroxylon balsamum), e a

    canela- sassafrs (Ocotea odorifera) alm de outras, de menor expresso no mercado.7, 8, 9

    A canela sassafrs apresenta odor agradvel, mas vale ressaltar que o seu uso no

    aconselhado, devido a presena do composto safrol (5-(2-propenyl)-1,3-benzodioxole)

    (Figura 2). Este composto teve seu uso banido desde a dcada de 60 pela Food Drugs

    Administration (FDA) por ser comprovadamente um agente cancergeno em ratos10, e por ser

    considerado pela Comisso Europeia sobre Sade e Proteco do Consumidor como

    genotxico e cancergeno.11

    Figura 2- Safrol (5-(2-propenil)-1,3- benzodioxole).

    Ainda no tocante ao aspecto toxicologico, estudos realizados com extratos de madeiras

    de jatob e amendoim12, indicam a presena de elevados teores de cumarina (Figura 3),

  • Introduo

    5

    composto tambm controlado em bebidas e alimentos e cujo teor para bebidas alcolicas esta

    limitado em 10 mg Kg-1 nas bebidas.13

    Figura 3- Cumarina (1,2-benzopirano).

    Cumarinas so lactonas do cido o-hidroxi-cinmico. So amplamente distribudos nos

    vegetais, mas tambm podem ser encontradas em fungos e bactrias.

    Devido ao seu odor caracterstico que se assemelha a baunilha14,15, foram amplamente

    utilizadas como aromatizantes pelas Industrias16. Porm evidenciada sua possivel toxicidade

    acima de certa concentrao passou a ser classificada como uma substncia txica17, porm

    no o suficiente para conduzir ao bito. Assim passou a ter utilizao restrita em produtos de

    limpeza e cosmticos. So conhecidas suas atividades anticoagulante, vasodilatadora,

    espasmoltica e antitrombtica. Um exemplo disto o extrato de castanha da ndia, muito

    utilizada contra varizes.17

    No ambito legal, no Brasil, a aguardente envelhecida tem sua denominao regulada

    por meio do decreto n. 6871, seo IV 18 segundo o qual: a aguardente e a cachaa so

    reconhecidas como sendo envelhecidas se contiverem em sua composio, no mnimo, 50%

    de aguardente de cana envelhecida por perodo no inferior a um ano, podendo ser adicionada

    de caramelo para a correo da cor. No existe qualquer especificao sobre o tipo de

    madeira do tonl ou o pr-tratamento, mencionando-se apenas a capacidade mxima do

    recepiente 700 litros. A madeira mais empregada o carvalho. Existem ainda as definies

    das categorias aguardente Premium e Extra Premium. A primeira refere-se a bebida que

  • Introduo

    6

    contm 100% de aguardente de cana ou destilado alcolico simples de cana-de-acar

    envelhecidos em recipiente de madeira, com capacidade mxima de 700 (setecentos) litros,

    por um perodo no inferior a 1 ano. A Aguardente Extra Premium, definida como:bebida

    que deve ser 100% envelhecida por perodo no inferior a 3 anos. No Brasil no esto

    estipulados os volumes especifcos dos tonis mas apenas seus volumes mximos. No exterior

    para algumas bebidas estes volumes so controlados como o caso do uisque americano que

    faz uso de tonies de 180 litros. 19

    Outro fato que merece maior ateno diz respeito a queima dos tonis, pois este

    processo influencia sobremaneira as qualidades quimicas e sensoriais do produto final. O

    tratamento trmico, tostas ou queimas, como so chamados, so prticas tradicionalmente

    aplicadas para facilitar o manuseio da madeira durante a dobra do tonl20, e tambm, e mais

    importante ainda do ponto de vista qumico, por criar um revestimento interno de carvo, o

    que promove a extrao de moleculas e ons presente na aguardente, e a dissoluo de

    molculas oriundas da pirlise ou solvolise das paredes do recipente pela bebida ali estocada.

    A lignina, no caso das bebidas sofre etanlise, originando molculas de fundalmental

    importncia sensorial para bebidas destiladas. 21

    A tostagem interna dos tonis ocorre em diferentes niveis e sua contribuio na

    contaminao da aguardente com hidrocarbonetos policiclico aromaticos oriundos da pirlise

    da madeira deve ser melhor investigada. reconhecido que a queima da cana conduz a

    contaminao de bebidas com HPAs 22. Porm ainda no h estudos que avaliem a influencia

    do tempo e da extenso (intensidade) nvel da queima de diferentes madeiras na composio

    qumica da aguardente.

    Com raras exesses23, os trabalhos publicados so majoritariamente restritos ao

    carvalho24, 25. O controle do tempo de envelhecimento, e as informaes mnimas sobre a

  • Introduo

    7

    composio qumica de madeiras brasileiras, que certamente influnciam nas qualidades do

    produto final, so questes ainda em aberto.

    Um ponto que constantemente avaliado em cachaas envelhecidas diz respeito ao

    teor de cobre. Trata-se de um parmetro constante nas chamadas anlises fisico-qumicas de

    bebidas. Este parmetro apresenta uma diminuio a medida que ocorre o envelhecimento da

    cachaa. Isto atribuido em geral ao fato os tonis terem sua superficie interna queimada

    antes do processo de estocagem, o que cria uma camada de material carbonizado adsorvente.

    Um estudo mais profundo sobre estes fatores e possveis efeitos memria destes tonis, sua

    reutilizao em processo de envelhecimento de bebidas recomendado.

    No h metodologia oficial recomendada que permita atribuir de forma inequvoca o

    tempo de envelhecimento e o impacto sensorial relativo aos fatores que influenciam o

    processo de envelhecimento: dimenso e o nmero reutilizaes dos tonis, tipo de madeira,

    influncia do tempo de exposio a determinado tipo de madeira, a porosidade de cada

    madeira.

    A legislao tambm no define os quesitos para a prtica do chamado descanso da

    bebida. Isto seria o repouso do destilado por perodos que variam de 1 a 6 meses em dornas de

    madeiras denominadas neutras (amendoim, jequitib, freij) ou em tonis de ao

    inoxidvel. Embora estas ltimas madeiras possam adicionar a bebida atributos sensoriais

    menos intensos, a neutralidade destas madeiras merece maior ateno.12, 13, 26

    No ambito da anlise qumica, os trabalhos se concentram das caracteristicas fsico-

    qumica das aguardentes envelhecidas em tonis de carvalho, as quais se constituem em

    padro comparativo para as demais madeiras. De forma semelhante ao que se observam para

    outros destilados envelhecidos, os resultados mostram que o envelhecimento da aguardente

    em tonis de carvalho altera a sua composio qumica e as suas propriedades sensoriais27.

    No demais ressaltar que ao passar por este processo, a cachaa apresenta uma melhoria

  • Introduo

    8

    com respeito aos padres gerais de qualidade estabelecidos pela legislao nacional em

    vigor28. Aps o perodo de 1 ano de armazenamento, a aguardente passa a apresentar maiores

    teores de acidez voltil, steres, aldedos, furfural, lcoois superiores, congneres, extrato seco

    e tanino. 28

    Os congneres correspondem a uma pequena frao de metablitos secundrios

    (aproximadamente 1% da composio) provenientes do processo fermentativo e da

    destilao29. Pela legislao18, congneres (componentes volteis "no lcool") a soma de

    acidez voltil, aldedos, steres, lcoois superiores e furfural. Nem todos os compostos

    provenientes durante o processo de fermentao e destilao so controlados, podendo-se

    destacar as sries dos cidos carboxlicos, dos alcois superiores, dos steres, dos aldedos,

    das cetonas, dos compostos nitrogenados e dos sulfurados. Os conjuntos destes compostos,

    carecidos de outros mais do origem ao bouquet da bebida.30

    A literatura informa que27,28 o aumento da acidez em uma bebida alcolica

    envelhecida em tonis de carvalho, no se deve somente ao aumento das concentraes de

    cidos carboxlicos provenientes da destilao ou de processos oxidativos envolvendo

    aldedos e demais compostos do prprio destilado. Tambm contribuem para o aumento a

    presena de substratos da madeira dissolvidos na bebida devido a etanlise .

    Por exemplo, o extrato do carvalho contm cidos fenlicos (glico, tannico, ferlico,

    sirngico e vanlico) em sua composio os quais so incorporados na bebida durante a

    maturao.

    Ainda que o sabor doce das bebidas envelhecidas seja uma das caracteristicas mais

    marcantes do envelhecimento suas origens ainda no esto totalmente esclarecida quais os

    compostos responsaveis por tal qualidade. Compostos como o maltol, o furfuraldedo, o etil

    hexanoato e o prprio etanol esto entre estes candidatos, mas certamente o aldedo fenlico

    vanilina, destaca-se entre os compostos mais relevantes para o sabor adocicado das bebidas

  • Introduo

    9

    envelhecidas. Suas caracteristicas associadas ao sabor de caramelo, toffe e baunilha esto

    sempre presentes em painis de anlise senosorial e em avaliaes com degustaes. Os

    compostos fenlicos tambm so associados ao sabor turfado, relacionado com a

    degradao da lignina durante o processo de queima dos tonis29. O fenol, os cresis (o-, m-,

    p-), o xilenol, os p- e m- etilfenol, o guaicol e os metoxi-fenois so considerados importantes

    para o impacto sensorial das bebidas envelhecidas29. Aldedos cinmicos e cidos benzicos

    tambm provenientes da degradao da lignina e das reaes ocorrentes nos destilados

    conferem o atributo defumado participando assim de forma relevante do bouquet das

    bebidas envelhecidas.31

    Ainda no muito explorado no mercado brasileiro de cachaa, mas certamente

    necessrio principalmente em se tratando se de bebidas envelhecidas e o uso da anlise

    sensorial. Esta do ponto de vista comercial de extrema importncia, pois as diferentes

    madeiras alteram sobremaneira as propriedades organolpticas do produto. Estas qualidades

    devem ser avaliadas, sem prejuizo de seus imapctos com relao a sade do consumidor, pois

    diferentes madeiras conduzem a diversos produtos que agradam diferentes paladares. Esta

    diversificao sadavel e se bem explorada, beneficia nossa bebida nacional.

    Os principais mtodos utilizados para a avaliao sensorial de destilados e, portanto

    da cachaa so: o afetivo e o descritivo32,33. O primeiro tem por objetivo avaliar a aceitao e

    a preferncia dos consumidores em relao a um ou mais produtos. O segundo permite a

    definio e a avaliao dos atributos sensoriais de produtos. Neste caso, so empregadas

    equipes treinadas de provadores. So considerados indicadores hednicos positivos a

    intensidade de cor, o sabor adocicado, e o aroma de baunilha e ou de cco.32, 33, 34

    A Anlise Descritiva Quantitativa35 de aguardentes de cana envelhecida em tonis de

    carvalho, indica que as caractersticas sensoriais das amostras mudam significativamente

    (p0,05) com o aumento do tempo de envelhecimento. O produto aps o perodo de 48 meses

  • Introduo

    10

    de envelhecimento caracteriza-se pelo aroma tpico de madeira, pela doura inicial e residual,

    pelo aroma de baunilha, pela colorao amarela e pelo gosto inicial e residual de madeira

    pronunciado. Por outro lado, o aroma alcolico, a agressividade e os sabores inicial e residual

    de lcool, indicadores hednicos negativos, se apresentam significativamente inferiores aos

    das amostras mais jovens, ou da mesma idade, mas mantidas em recipiente de vidro. A Figura

    4 exemplica um grfico de gerador hednico33.

    Figura 4- Correlao entre descries objetivas de anlise sensorial da cachaa e ndice global de preferencia. 33

    Em estudos recentes33 utilizando a anlise sensorial descritiva foram sugeridos como

    possiveis descritores para a avaliao sensorial da aguardente os seguintes parametros:

    oleosidade, intensidade de cor amarela, calor, ardor, doce, acidez, maciez/suavidade, amargor,

    floral, frutado, madeira e lcool. Paralelamente, para o mesmo conjunto de amostras foi

    aplicado o teste sensorial afetivo. As sensaes: visiva, olfativa, gustativa e gustolfativa,

    foram avaliadas. Os resultados tanto do mtodo descritivo como do mtodo afetivo indicaram

    que as cachaas melhores classificadas foram as envelhecidas em barris de carvalho por um

    perodo no inferior a 24 meses.33

  • Introduo

    11

    A aceitao de aguardentes envelhecidas em pequenos tonis de madeiras (15 L) de

    carvalho e tambm das madeiras brasileiras: amarelo, amendoim, balsamo, jatoba, louro, pau

    darco, pau doleo, pereiro tambm foi objeto de estudo36. A anlise de variancia indicou

    diferenas siginificativas nos resultados dos testes sensoriais para os itens aroma, sabor e cor

    para cada uma das madeiras. As amostras envelhecidas em carvalho, blsamo, jatob e

    amendoim obtiveram as melhores pontuaes de aceitabilidade no item aroma. Uma

    distribuio similar foi observada para o quesito sabor. As cachaas envelhecidas em

    carvalho, pereiro e amendoim apresentaram valores mdios bastante similares entre si, e

    superior aos demais. Com respeito a cor, novamente carvalho, amendoim e louro canela, nesta

    sequencia, foram as preferidas seguidas por pereiro e jatob. Embora a anlise sensorial seja

    reconhecida como ferramenta decisiva na apresentao de um novo produto ao mercado37,38, a

    legislao brasileira no contempla parmetros organolpticos.

    A avaliao sensorial de aguardentes aps diferentes tempos de armazenamento em

    tonis de carvalho demonstrou que a sua aceitao cresce a medida que aumenta o tempo de

    envelhecimento. As maiores alteraes ocorrem nos primeiros 24 meses, a partir do que a

    melhoria passa a ocorrer de forma assinttica39. pequena a diferena nas propriedades

    sensoriais entre a mesma bebida aps quatro e cinco anos de envelhecimento. As aguardentes

    envelhecidas so preferidas pelos consumidores, com respeitos as aguardentes no

    envelhecidas, e aos produtos envelhecidos parcialmente adicionados de aguardentes no

    envelhecidas.

    A compreenso do processo de maturao da cachaa, certamente requer o

    conhecimento da variao da sua composio qumica. O melhor conhecimento do perfl

    qumico da aguardente envelhecida importante para melhor descrever, suas propriedades e

    os seus eventuais efeitos sobre a sade do consumidor. Para tanto o desenvolvimento de

    metodologias acessveis ao pequeno produtor e que possam proporcionar confiabilidade,

  • Introduo

    12

    qualidade e rastreabilidade dentro da cadeia produtiva deve ser incentivado. A acessibilidade

    a estas metodologias fundamental para a sua implementao e consequente melhor controle

    da qualidade da aguardente.

    A composio em compostos fenlicos muito importante devido a sua influncia na

    qualidade de destilados40. O conhecimento atual esta em quase sua totalidade baseado nos

    estudos realizados com tonis de carvalho. Novamente no caso da aguardente brasileira os

    desafios so estimulantes, pois existe uma ampla gama de madeiras nativas e que so

    utilizadas no processo de envelhecimento de bebidas de forma no padronizada.

    Conforme j antecipado neste trabalho, durante o processo de envelhecimento a

    composio qumica da aguardente passa por diversas mudanas, devido s reaes que

    ocorrem no prprio destilado, sejam estas entre os compostos do prprio destilado, quer entre

    estes e os compostos extrados da madeira40,41. Tambm no devem ser negligenciadas

    alteraes que venham a ocorrer devido permeabilidade dos tonis, que envolvem a perda de

    molculas volateis como tambm a oxigenao do destilado que envolve varias reaes de

    oxidao40,41,42. Como exemplo positivo pode-se citar a diminuio do teor de dimetilssulfeto

    (CH3SCH3), composto sulfurado proveniente da decomposio de aminocidos

    sulfurados40,43, durante o processo de fermentao, e cuja presena relacionada como um

    frequente defeito em aguardentes mais jovem. Em amostras de uisque foi observado uma

    diminuio dos teores de dimetilssulfeto em ate quatro vezes num perodo de 5 anos de

    envelhecimento40

    A influncia do oxignio que permeia pelos poros da madeira, importante, mas trata-

    se de um assunto que divide opnies42,44. O comportamento fisico-qumico das aguardentes

    armazenadas em recipientes de vidro e em recepientes de madeiras45,46 conduz a

    caractersticas qumicas e sensoriais diferentes. Em funo do tempo, variaes significativas

    ocorrem na composio qumica das aguardentes armazenadas em recipientes de madeira.

  • Introduo

    13

    Para amostras armazenadas em recipientes de vidro, a exceo concentrao de acetato de

    etila47, estas diferenas so menos pronunciadas. Isto se deve ao fato das reaes de

    esterificao terem lugar tambm durante o armazenamento, mesmo que em recipientes

    inertes e em condies que dificultem trocas com o meio externo.

    O esquema 1 e 2 exemplificam reaes que ocorrem em ambos os tipos de recipientes

    (madeiras e outros inertes). O esquema 1 mostra a reao do cido cetico com o etanol,

    gerando o acetato de etila, o ester majoritrio em aguardentes.

    CH3COOH + CH3CH2OH + CH3COOCH2CH3 + H2O Esquema 4 Reao do cido actico com etanol gerando acetato de etila durante o processo

    de maturao.

    O esquema 2 ilustra a reao de etanol com acroleina gerando 1,1,3- trietoxipropano.

    A acrolena j foi sugerida como um marcador de envelhecimento, seu emprego num modelo

    real nunca foi reconhecido.48

    Esquema 5 Reao da acroleina durante o perodo de maturao.48

    Entre os compostos extraidos dos tonis, aqueles relacionados com a degradao da

    lignina encontram-se entre os mais relevantes os aldeidos aromaticos, os cidos fenlicos e os

    aldedos cinmicos que so considerados responsveis por muitas das caracteristicas

    imprimidas bebida pelo processo de envelhecimento. O Esquema 3 exemplifica algumas

    reaes que podem ocorrer com compostos fenlicos provenientes da etanlise da lignina

    durante o processo de envelhecimento.

  • Introduo

    14

    O C H 3

    O H

    C O C H 3

    O C H 3 O H

    C O C H 2 C H 3

    c i d o F e r l i c o A c e t o v a n i l o n a P r o p i o v a n i l o n a

    O C H 3 O H

    C H C H C H O

    O C H 3 O H

    C H O

    O C H 3

    C H C H C O O H

    O H

    O C H 3 O H

    C O O H

    O C H 3 O H

    C O O C 2 H 5

    C o n i f e r a l d e d o V a n i l i n a c i d o V a n l i c o V a n i l a t o d e E t i l a

    O C H 3 O H

    C H C H C H O

    H 3 C O H 3 C O O C H 3 O H

    C H O

    H 3 C O O C H 3 O H

    C O O H

    H 3 C O O C H 3O H

    C O O C 2 H 5

    S i n a p a l d e d o S i r i n g a l d e d o c i d o S i r n g i c o S i r i n g a t o d e E t i l a

    k 1 k 2 k 3

    k ' 1 k ' 2 k ' 3

    Esquema 6 Seqncia de reaes de para converso de compostos fenlicos relacionados

    lignina durante o processo de estocagem em tonis de madeira, onde ki e ki (i= 1,2,3...) so

    constantes de velocidade especifica para as reaes de converso.40

    Conforme esperado, madeiras diferentes devem contribuir de forma diferente para o

    perfil qumico da aguardente. Assim, a anlise cromatogrfica de diferentes extratos de

    madeiras: jatob, amendoim, cabreva parda, castanheira, pequi, canela sassafrz e carvalho,

    indicam que para os compostos estudados a maior diferena entre as madeiras brasileiras e o

    carvalho reside nos teores dos compostos cumarina, catequina, siringaldedo, e

    coniferaldedo49. Tais dados merecem ateno tambm do ponto de vista de sade, pois a

    cumarina como j mencionada classificada como txica, e elevados teores de cumarina

    foram detectados em amostras de jatob (12 mgL-1) e carvalho (2 mgL-1).

    interessante a comparao entre a capacidade e a atividade antioxidante de

    aguardentes envelhecidas em madeiras brasileiras e em carvalho. A oxidao de lipdios se

    inicia com a formao de radicais livres, e os hidroperxidos formados podem causar

  • Introduo

    15

    alteraes indesejaveis em leos, gorduras ou alimentos. Alm disto, os produtos da oxidao

    lipdica podem desencadear reaes de peroxidao, que resultam em problemas para saude.

    Todos os componentes celulares so suscetiveis ao das especes reativas do metabolismo

    do oxignio (ERO), porm a membrana celular uma das mais atingidas. A peroxidao

    lpidica o processo atravs do qual espcies reativas de oxignio agridem os cidos graxos

    polinsaturados dos fosfolipdios das membranas das clulas50,51. O esquema 4 exemplifica as

    principais etapas envolvidas no processo de perxidao lipdica.

    Iniciao LH + OH (ou LO) > L+ H2O (ou LOH)

    Propagao L + O2 > LOO

    Propagao LH + LOO > L+ LOOH

    Terminao LOO + L. > LOOL

    Terminao LOO + LOO. > LOOL + O2

    Esquema 4- principais etapas envolvidas no processo de peroxidao lipdica (LH- .cido

    graxo polinsaturado; OH ou LO- radical alcoxila; L -radical lipdico;LOO - radical

    peroxila).

    Portanto compostos que possam interromper a propagao estes ciclo apresentam

    caracteristicas antioxidantes. Os extratos etanlicos de madeiras foram avaliados em

    experimentos em que foi medido o efeito antioxidante. Estes se basearam na capacidade de

    captura e atividade junto ao radical semi-estvel DPPH como tambm na inibio da

    peroxidao lipdica iniciada por metmioglobina em uma emulso gua/leo.

    Estes parametros foram avaliados para diferentes extratos de aguardentes preparados a

    partir de carvalho e de madeiras brasileiras (Figura 5). As madeiras brasileiras apresentam um

    poder de inibio do processo de peroxidaco lipdica induzida por metmioglobina, superior

  • Introduo

    16

    ao do carvalho52. Entretanto os extratos de carvalho possuem maior capacidade e rapidez de

    captura de radicais peroxila que os extratos das madeiras brasileiras. 52

    Figura 5- Histograma indicando a mdia do consumo de oxignio para cada espcie.

    ndice abaixo da unidade indica um efeito antioxidante. 52

    Assim as caractersticas sensoriais positivas das madeiras jatob e amendoim somam-

    se agora s suas propriedades antioxidantes. Algumas madeiras tradicionalmente utilizadas no

    envelhecimento da aguardente como canela-sassafrz, castanheira e louro-canela,

    apresentaram efeito contrrio, ou seja, pr-oxidante, e principalmente no caso da primeira, seu

    uso no seria recomendvel.

    Experimentos eletroqumicos, embora sem identificar quais os compostos envolvidos,

    indicaram que extratos de carvalho e de cabreva-parda apresentam capacidade antioxidante

    semelhante entre si.53

    A composio qumica de aguardente envelhecida quando interpretada com auxlio da

    anlise quimiomtrica permite identificar e classificar o tipo de madeira dos tonis utilizados

    no envelhecimento de bebidas. Assim por exemplo em trabalho realizado anteriormente e aqui

    nesta exemplar discutido49, foram utilizados com resultados no to satisfatrios, os valores

  • Introduo

    17

    de concentrao de 16 compostos fenlicos e cumarinas para classificao de tonis

    construidos com diferentes madeiras. O emprego de um fingerprint cromatogrfico em

    associao com a anlise dos componentes principais (PCA) permitiu a distino entre as

    diferentes espcies de madeiras utilizadas na confeco de toneis. A identificao de picos

    cromatograficos referentes aos compostos que possam vir a ser possveis marcadores de

    autenticidade, e a identificao destes mesmos picos foi realizada por meio de cromatografa

    liquida associada a espectrometria de massas. Assim, a cumarina revelou-se como um

    composto determinante para a classificao de amostras de jatob, o cido elgico para

    classificao de carvalho, e o 5-Hidroxi-metilfurfuraldedo para as madeiras cabreuva-parda e

    amendoim.13,49

    A capacidade de diferenciar madeiras empregadas no envelhecimento de aguardente

    (amburana, jequitib, balsamo e carvalho) atravs da infuso direta da amostra em ionizao

    por eletrospray associada a espectrometria de massas no modo negativo( ESI(-)-MS) tambm

    foi investigada54. A aplicao da anlise de componente principal permitiu classificar as

    madeiras empregas no envelhecimento baseando-se nos ons diagnosticos para cada uma. A

    naringenina e a pectolinaringenina se apresentaram como marcadores da cachaa envelhecida

    em amburana, cido caprlico, cido caprico e liquiritigenina como marcadores das cachaas

    envelhecidas em jequitib, genisteina, biocanina e genistena como marcadores da madeira de

    blsamo e o cido elgico e o etil galato como compostos responsaveis pela caracterizao

    das aguardentes envelhecidas em carvalho54. Algumas estruturas molecurares esto

    exemplificadas na Figura 6

  • Introduo

    18

    Figura 6- Estrutura molecular de alguns compostos encontrados em madeiras brasileiras e carvalho.

    Embora as tecnicas acimas mencionadas sejam de grande valia para a compreenso, o

    controle da identificao de especies de madeira atualmente realizado por especialista, de

    forma comparativa e visual, atravs de consultas a xilotecas e a livros especialisados.

    Atualmente a identificao de madeiras se da atravs de anlise visual que realizada

    considerando principalmente os seus rgos reprodutores (flores e frutos), e tambm outras

    caractersticas morfolgicas da rvore (casca, folhas, etc.) e mesmo em alguns casos pela

    anlise do seu aroma55. Em muito a experincia do profissional influi nesta anlise. O MAPA

    (Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento) recomenda efetuar a identificao

    atravs do seguinte quesito Consiste no exame da estrutura anatmica da madeira pelo

    aspecto macroscpico (10X) e microscpico (40 a 400X), cujo mtodo o mais seguro para a

    identificao correta da madeira56. A Figura 7 ilustra um caso onde a habilidade do analista

  • Introduo

    19

    requerido. A Figura mostra duas espcies diferentes da mesma famlia e que so facilmente

    confundidas por similaridades dos seus troncos.

    Figura 7- Exemplo da anlise realizada considerando caracteristicas morfologicas para diferenciar uma amostra de maparajuba (Manilkara bidentata ssp. Surinamensis) e uma amostra de maarandubinha (Manilkara paraensis) que so facilmente confundidas.57

    Alm de toda a diversidade de madeiras exploradas no pas para o envelhecimento da

    aguardente brasileira assim como para outras bebidas destiladas o produtor da aguardente

    pode fazer uso de caramelo para correo de cor nas aguardentes envelhecidas. Segundo a

    legislao, o uso deste aditivo pode ser efetuado, sem a necessidade de informar sobre o seu

    teor 18 e to pouco sua composio. Embora no mercado existam diversos tipos de de

    caramelo, suas formulaes e a composio no so declaradas no rtulo, sendo classificados

    somente por cdigos. A metodologia recomendada pelo MAPA para anlise de caramelo58

    avalia qualitativamente somente sua presena positiva ou negativa utilizando o teste que se

    baseia na intensidade da cor utilizando.

  • Introduo

    20

    A comparao do espectro eletrnico na regio do UV-vis para amostras adicionadas

    de caramelo, de amostras envelhecidas em carvalho e certificadas (padro de referncia)

    permite identificar a presena e quantificar o teor de caramelo em bebidas59. Assim, por esse

    procedimento possvel estimar o teor de caramelo presente nas aguardentes, e ainda

    informar se a amostra esteve em contato com a madeira de carvalho. Foram avaliados os

    teores de caramelo em amostras de usque americano, usque escocs e conhaques finos

    constatando-se que as amostras dos usques escoceses apresentaram teores de caramelo59

    superiores as demais. Por sua importncia no quesito envelhecimento, o caramelo, se inclui no

    grupo de itens a serem controlados, podendo indicar se a bebida foi mesmo envelhecida em

    carvalho ou simplesmente adicionada de caramelo. Vale ressaltar que a adio de caramelo

    no geralmente pratica utilizada por pequenos e mdios produtores.

    Certamente a aguardente brasileira, necessita de mais ateno e de investimentos tanto

    dos setores privados e do pblico para atingir seu status de bebida de qualidade. Para tanto

    necessrio uma melhor definio dos padres que correspondam qualidade de uma bebida

    corretamente envelhecida. Embora a aguardente brasileira envelhecida ainda no possua a

    devida ateno com relao a suas caracteristicas sensoriais e sua composio qumica, os

    primeiros passos foram dados. longo o caminho a percorrer, mas isto s poder ser

    alcanado atravs da unio de todos os setores responsveis pela qualidade de aguardente

    brasileira, fato este que ira contribuir significativamente para a aceitao e a consolidao do

    status de nossa bebida nacional.

  • Objetivos

    21

    2.OBJETIVOS

  • Objetivos

    22

    2. OBJETIVOS

    A certificao de produto com controle de toda cadeia produtiva item necessario em

    bebidas de alto nvel, e a aguardente brasileira ainda explora pouco as ferramentas disponveis

    para tal exercicio. Atualmente, a certificao de bebidas envelhecidas feito atravs de

    constantes auditorias e a identificao das madeiras utilizada no envelhecimento ainda

    ditada pela conferncia de documentos emitidos pelos fornecedores. A elaborao de

    metodologias que venham a auxiliar o processo de identificao de madeiras de interesse

    num futuro planejamento de certificao da cadeia produtiva da cachaa. Assim, procurando

    contribuir neste escopo pretende-se desenvolver metodologias simples e acessveis que

    permitam identificar as madeiras em que bebidas foram armazenadas.

    Para isto, ser efetuada a anlise cromatografica (HPLC-DAD) de extratos de

    madeiras, com a finalidade de identificar possiveis marcadores de espcies. Tambm ser

    utilizado o espectro eletrnico na regio do UV e utilizando ferramentas quimiometricas

    explorar o poder de separao entre as especies em funo dos devidos espectros. Assim,

    modelos iro ser elaborados e sua autoconsistencia testada com amostras comerciais

    envelhecidas e em diferentes tipos de madeiras devidamente certificadas.

    Adicionalmente, alm da extenso no controle de qualidade de outros destilados

    envelhecidos, esta metodologia poderia ser til para a identificar espcies de madeira para o

    uso em marcenaria, ou mesmo para fins de controle de explorao ilegal.

    Portanto modelos que possam auxiliar na identificao de madeiras em situaes em

    que nem sempre se pode contar com a presena de um especialista para tal atividade devem

    ser estimuladas e desenvolvidas.

  • Materiais e Mtodos

    23

    3. MATERIAIS E MTODOS

    3.1. Reagentes

    Todos os solventes e reagentes utilizados foram de grau analtico e ou pureza

    cromatogrfica e adquiridos da Merck (Darmstadt, Alemanha) e da Mallinckrodt

    (Phillipsburg, NJ EUA). A gua utilizada (18 M cm-1) foi destilada e posteriormente

    deionizada em um sistema Milli-Q da Millipore (Bedford, MA EUA).

    3.2. Amostras de madeiras

    A amostra de cachaa devidamente certificada pelo produtor, no envelhecida

    (47%v/v), sem adio de acar e utilizada na preparao dos extratos, foi gentilmente doada

    por um grande e tradicional produtor do Estado de So Paulo. As amostras de amendoim

    (Pterogyne sp.), louro-canela (Aniba parviflora), jatob (Hymenaea courbaril), canela

    sassafrs (Ocotea pretiosa), jequitib-rosa: Cariniana legalis: jequitib-branco: Cariniana

    estrellensis) e cabreva-parda (Myrocarpus frondosus), blsamo (Myroxylon balsamum),

    amburana (Amburana cearensis) e castanheira (Bertholletia excelsa) foram cedidas pelos

    Laboratrios de Madeiras e Estrutura de Madeiras da Universidade de So Paulo. As amostras

    de carvalho (Quercus sp.) devidamente certificadas foram cedidas pelo Prof. John Piggot do

    Departamento de Biocincias de Strathclyde (Esccia, Glasgow).

  • Materiais e Mtodos

    24

    3.3. Preparo dos extratos

    Seguindo procedimento anteriormente por49,52 as amostras de madeiras foram modas e

    o p peneirado de forma a obter partculas de 100 mesh de dimetro. Estes materiais foram

    ento extrados com cachaa no envelhecida com graduao alcolica de (47%v/v; pH = 4,7

    0,2), na proporo 0,010g/mL. O processo de extrao foi realizado durante 26 dias sob

    agitao constante em uma mesa agitadora da marca Tecnal modelo TE - 14, a temperatura

    ambiente (25 2) C e ao abrigo da luz. As amostras, sempre em duplicatas, aps preparadas

    foram filtradas em papel de filtro quantitativo e armazenadas a temperatura ambiente. No total

    foram preparados 93 extratos, sendo 13 de carvalho, 8 de amendoim, 9 de jatob, 8 de

    cabreuva parda, 10 de amburana, 12 de blsamo, 5 de canela-sassafrz, 12 de castanheira, 5

    de louro canela e 2 de canela sassafrs. As amostras foram selecionadas baseadas em sua

    utilizao, representatividade e disponibilidade no mercado. Foram testadas 50 amostras de

    cachaas envelhecidas em diferentes tipos de madeiras. O conjunto de cachaas envelhecidas

    testadas foi assim contruido: 9 de carvalho, 6 de amburana, 6 de amendoim, 10 de blsamo, 2

    de cabreva parda, 3 de canela-sassafrz, 5 de castanheira, 7 de jequitib, 1 de louro-canela e

    1 de jatob.

    3.4. Espectros eletrnicos (UV-vis)

    Os espectros de absoro para as amostras, na regio de 200 nm a 400 nm, foram

    coletados em um espectrofotmetro HP 8152A com resoluo de 2 nm e utilizando-se de

    cubetas de quartzo de caminho tico de 1cm (Hellma, Mllheim, Germany). Com a finalidade

    de normalizar os resultados, quando necessrio as amostras foram diluidas em etanol/gua

  • Materiais e Mtodos

    25

    40% v/v com o objetivo de se ajustar o valor da absorbncia obtida em 220 nm ao valor

    unitrio.

    3.5. Condies Cromatogrfico

    Os cromatogramas foram obtidos por injeo direta da amostra em cromatgrafo para

    fase lquida Shimadzu modelo 10 AD equipado com um detector de arranjo de diodo modelo

    SPDM6A, operando em 280 nm, utilizando uma coluna C-18 Shimpack com dimenses de 2

    mm x 250 mm x 4,6 m, acoplada a uma pr-coluna Shim-pack CLC G-ODS (30 mm x 4,6

    mm). O injetor utilizado foi Rheodyne modelo 7725i, com ala de amostragem de 5 L. A

    fase mvel com vazo de 0,4 mL/min consistia em uma mistura de solventes: A (gua/ cido

    actico 98:2% v/v) e B (metanol/gua/ cido actico, 70:28:2% v/v), utilizando gradiente de

    eluio com a seguinte programao: 0-3min: B 0% em A; 3-25min: B 40% em A, 25-43min:

    B 60% em A, 43-55min: B 60% em A, 55-60min: 80% B em A; 6065min: 80% B em A; e

    6569min: 0% B.

    3.6. Anlise dos fragmentogramas via insero direta.

    As amostras foram injetadas diretamente em espectrometro de massas tipo ion trap

    Bruker Datonics modelo Esquire utilizando uma bomba seringa Kdscientific modelo KDS-

    100-CE num fuxo continuo de 60 L/hora.

  • Materiais e Mtodos

    26

    3.7. Anlise multivariada

    3.7.1. Tratamento dos dados espectrais

    Os dados espectrofotomtricos foram normalizados como forma de pr-tratamento,

    para que cada varavel possa ter o mesmo peso em sua contribuio na elaborao do modelo.

    Aps este procedimento foi aplicado a primeira derivada (dA/d) como pr-tratamento. Este

    procedimento tem por objetivo minimizar variaes na linha de base dos espectros em funo

    das condies de obteno do espectro, tais como variao de temperatura, solvente utilizado

    entre outros interferentes60. Os dados gerados foram aplicados na construo de uma matriz

    93 linhas x 90 colunas. As linhas correspondem as 93 amostras e as colunas aos dados de

    absorbncia (220-400 nm a cada 2 nm) para cada uma destas amostras (extrato). Foi ento

    aplicado a nalise de componentes principais (PCA), anlise hieraquica de cluster (HCA) e

    nalise discriminante linear (LDA)

    Na anlise multivariada os dados so arranjados em uma matriz Xnxp, de n objetos,

    arranjados nas linhas e p variveis, arranjadas nas colunas. Os objetos podem ser: amostras,

    molculas, materiais, indivduos, etc.

    As variveis podem ser absorbncias em diferentes comprimentos de onda, sinais

    analticos em funo do potencial eltrico ou do tempo de reteno, concentrao de

    elementos ou outras propriedades fsicas.

    A anlise de PCA consiste em identificar dentro de um hiperespao qual direo que

    contm o maior nmero de informaes. Por meio de projees dos resultados anliticos de

    cada amostra no espao formado pelas novas componentes principais possivel demostrar

    diferenas entre as amostras utilizadas. (grficos de scores) deteminando quais as principais

    variveis envolvidas (grfico de loading).

  • Materiais e Mtodos

    27

    A HCA um mtodo de anlise exploratria que busca classificar diferentes objetos

    dentro de um grupo, de modo que o grau de associao entre dois ou mais objetos seja

    mximo se pertencerem ao mesmo grupo (cluster) ou mnimo se forem diferentes. A HCA

    pode ser usada para observar comportamentos, porm no fornce explicae sobre estes, ou

    seja, este tipo de anlise agurpa as amostras, porm sem dar informaes de como as agrupou.

    O modelo de classificao foi elaborado utilizando anlise discriminante linear (LDA).

    A LDA um procedimento de classificao que maximiza a varincia entre as categorias e

    minimiza a varincia dentro das categorias. Este mtodo torna um nmero de funes

    ortogonais discriminantes lineares iguais ao nmero de categorias menos um (n-1).60, 61

    Foram testadas 50 cachaas para validao do modelo de anlise discriminante linear

    (LDA), aplicando validao cruzada (Tabela 6 apndice 1). Na validao cruzada (leave-one-

    out) uma amostra retirada aleatoriamente do conjunto de dados, e um novo modelo gerado

    com as amostras (n - 1) restantes (modelo de calibrao). A amostra retirada testada

    fornecendo uma primeira validao do modelo criado. Esse processo ser obtendo-se ento

    n modelos. Para cada amostra retirada, um modelo criado e testado. a exatido em

    classificao do modelo para n validaes e testes ento determinada.60, 61

    Foram desenvolvidos dois modelos, como ser discutido na seco 4. Um

    contemplando somente extratos de madeiras e outro considerando cachaas comerciais.

    A anlise multivariada (PCA) foi realizada utilizando os softwares The Unscrambers

    V9.8. A anlise hierarquica de cluster e a anlise discriminante linear foram realizadas

    utilizando o programa MINITAB Statistical Software verso 14.

  • Materiais e Mtodos

    28

    3.7.2. Tratamento dos dados cromatogrficos

    O conjunto de dados obtidos por anlise cromatogrfica foi primeiramente reduzido a

    um numero menor de pontos, para a adequao operacional dos software utilizados. Aps este

    passo os cromatogramas foram alinhados para remover eventuais deslocamentos de picos

    cromatogrficos oriundos de pequenas oscilaes das condies de anlise utilizando o

    algoritimo COW (Correlation Optimization Warping) 62. Foi ento realizado alinhamento da

    linha de base pelo mtodo MSC (multilpe scaterring curve) e construda uma matriz com 18

    linhas x 300 colunas.

    3.7.3. Anlise cromatogrfica acoplada a espectrometria de massas (HPLC-ESI-MSn)

    Os extratos foram analisados em um cromatografo para fase lquida da Shimadzu

    modelo Prominence, equipado com duas unidades de bombeamento de solvente (bombas)

    modelo 20 D, injetor manual Rheodyne 8125 com um loop de 20 L. A coluna e as condies

    cromatogrficas utilizadas so as mesmas referentes a descrita para o mtodo HPLC-DAD.

    Os espectros de massa foram coletados nos modos positivo e negativo via ionizao

    por eletrospray em um espctrometro de massa do tipo ion trap Bruker Datonics modelo

    Esquire. As condies de ionizao esto listadas na Tabela 1.

  • Materiais e Mtodos

    29

    Tabela 1- Parametros utilizados no analisador de espesctrometria de massas

    Parametros Modo ESI(-) Modo ESI(+)

    Accumulation time (ms) 30 30

    Averages 5 5

    Scan range (m/z) 70-500 70-500

    Ion charge control target 10000 30000

    Trap drive 52.0 45.3

    Skim 1 (V) -21.6 +21.6

    Skim 2 (V) -6.0 6.0

    Octapole radiofrequency (Vpp) 150.0 150.0

    Lens 1 (V) +5.0 -5.0

    Lens 2 (V) +60.0 -60.0

    Octopole (V) -2.88 +2.88

    Capillary Exit (V) -76.6 Volt -76.6

    Capillary Exit Offset (V) -68.6 +68.6

    High-voltage capillary (V) +2800 -2800

    Dry gas temperature (C) 365 365

    Dry gas (L/min) 9.00 9.00

    Nebulizer (psi) 40.0 40.0

    Octapole -2.40 +2.40

  • Resultados e discusso

    30

    4. RESULTADOS E DISCUSSO

  • Resultados e discusso

    31

    4. RESULTADOS E DISCUSSO

    4.1. Anlise multivariada aplicada aos cromatogramas obtidos HPLC-DAD (280 nm)

    Esta etapa consequencia natural do trabalho de investigao da composio e das

    caracteristicas qumicas das madeiras brasileiras e do carvalho realizado durante o perodo de

    mestrado63. Naquela ocasio a composio fenlica e cumarica de amostras de extratos de

    madeiras brasileiras foram investigadas. O tema foi expandido utilizando ferramentas

    quimiomtricas, pois simplesmente os teores dos dezesseis (16) compostos fenlicos e

    cumaricos per se no foram suficientes para alcanar a desejada separao dos extratos das

    diferentes espcies de madeiras.

    A abordagem empregada consiste na utilizao de todo o perfl cromatogrfico

    (fingerprint) obtido de cromatogramas obtidos em cromatogrfo para fase lquida acoplado

    a um detector de arranjo de diodo, operando em 280 nm. Optou-se por trabalhar com o = 280

    nm por ser este um comprimento de onda onde aborvem muitos dos compostos extrados

    durante o processo de maturao de bebidas. Tambm decidiu-se nesta fase exploratria

    utilizar um nmero reduzido de amostras.

    Primeiramente os resultados extrados dos cromatogramas oriundos das eluies

    cromatogrficas foram submetidos a uma reduo de nmero de pontos. Isto porque os

    cromatogramas obtidos experimentalmente so compostos de aproximadamente 3.000 pontos

    e os programas MININTAB e Unscrambler utilizados no comportam tal numero de

    variaveis. Para tanto foi utilizado um algoritimo, o qual foi desenvolvido no Labortrio de

    Anlise de Sistema de Energia Eltrica (EESC-USP) que permitiu a reduo do numeros de

    pontos a 300, porm sem prejuizo da definio dos pcos cromatogrficos oriundos das

    separaes analticas.

  • Resultados e discusso

    32

    Durante o processo de eluio, algumas variaes podem ocorrer no tempo de reteno

    de alguns compostos devido a diversos fatores como presso do sistema e temperatura. Tais

    deslocamentos podem intereferir negativamente nos resultados quimiomtricos, pois um pico

    deslocado pode ser entendido como que indicando a presena de outro composto e

    erroneamente ser considerado um descritor qumico durante o processo de aplicao da

    anlise multivariada.

    Aps a reduo no nmero de pontos aplicou-se a anlise de componentes principais

    aos perfis cromatogrficos obtidos pelo monitoramento a =280 nm. Isto permitiu agrupar 25

    extratos de madeiras utilizados em 6 grupos (11 carvalho, 3 amendoim, 4 cabreva-parda, 2

    canela sassafrz, 2 pequi e 3 jatob).

    A distino de 6 cluster independentes so observados nos grficos de score da PCA

    (Figura 8)

    .

    Figura 8- Grficos de score para PCA ( PC1 x PC2) dos extratos etanlicos de madeiras avaliados por HPLC, a partir da anlise do fingerprint cromatogrfico (= 280 nm).

  • Resultados e discusso

    33

    A soma das 3 primeiras PCs explicam 75% da varincia dos dados ( PC1 52%, PC2

    13% e PC3 10%). Os dados da PC1 permitiram separar os extratos de jatob das demais

    madeiras. Quando se analisa um grfico de loading usando um perfl espectral ou

    cromatogrfico, uma possiblidade interessante a de plotar-se os valores de loading versus as

    variavis. No caso explorado nesta discusso, foram utilizados valores de loading versus

    tempo de reteno. Portanto, as variveis (tempo de reteno) mais importantes apresentam os

    maiores valores, e como os tempos de reteno esto relacionados com os picos

    cromatogrficos pode-se determinar quais compostos so mais relevantes na PCA. Os

    grficos de loading (PC1 vs tempo de reteno) gerados a partir do perfl cromatogrfico dos

    extratos de madeira, mostram dois picos com elevados valores de loading que contribuem na

    separao observada na PC1 (Figura 9).

    10 20 30 40 50 60

    -0.05

    0.00

    0.05

    0.10

    0.15

    0.20

    0.25

    0.30

    cumarina

    (38,6-39,4)

    load

    ing (

    PC

    1)

    tempo (min)

    pico desconhecido

    (31,1-31,7)

    Figura 9- Grfico de loading para os valores da PC1, onde se observa os picos com maiores valores e seus respectivos tempos de reteno.

    Um dos picos eluindo em 31,1-31,7 minutos, anteriormente atribuido a presena do

    composto epicatequina, teve sua identificao revista, agora fazendo-se uso de um

  • Resultados e discusso

    34

    cromatografo para fase lquida acoplado a um espectrometro de massas de multiplos estagios

    on trap. O segundo pico eluindo em 38,6-39,4 minutos foi identificado como sendo

    cumarina (1,2-benzopirano).

    Como os valores de PC1 foram elevados, e deram origem a uma separao entre os

    extratos de jatob dos demais extratos de madeiras, a diferenciao para os extratos de

    carvalho, amendoim, cabreva-parda, canela sassafrz e pequi foram realizadas utilizando-se

    os valores da PC2 e PC3 (Figura 10).

    Os extratos de carvalho e cabreva-parda foram diferenciados entre si baseados nos

    respectivos valores de PC2. Os grficos de loading para PC2 (Figura 11) mostram a presena

    de um pico no identificado com alto poder de discriminao, eluindo entre 45.7-47.0

    minutos, para os extratos de cabreva-parda. Tambm fica evidente neste mesmo grfico e a

    presena do composto cido elgico para os extratos de carvalho, eluindo entre 52.1-53.8.

    Estes dois picos so determinantes para discriminao destas duas espcies.

  • Resultados e discusso

    35

    Figura 10- Grfico de scores (PC2 13%x PC3 10%) para os extratos etanlicos obtidos a partir dos cromatogramas (= 280 nm).

    Os extratos de cabreva-parda, amendoim e canela sassafrz tambm podem ser

    diferenciados ente si pelos seus respectivos valores de PC2. Os graficos de loading na PC2 (

    Figura 11) mostram que a presena de cumarina (tr= 38.2-39.2 min.) e de outros trs

    compostos ainda no identificados eluindo entre os tempos de reteno de 48.1 a 51.7 so

    importantes para a identificao da canela sassafrz ao passo que os picos com tempo de

    reteno 10,3 a 11,7 minutos permitem a discriminao dos extratos de amendoim. O

    composto correspondente a este pico o principais descritor para a diferenciao entre os dois

    extratos. O pico observado na amostra de amendoim foi identificado por meio de

    cromatografia liquida com detector de arranjo de diodo, como sendo 5-(hidroximetil) (tr=10,

    3-11,7 min.).

  • Resultados e discusso

    36

    10 20 30 40 50 60

    -0.20

    -0.15

    -0.10

    -0.05

    0.00

    0.05

    0.10

    0.15

    0.20

    5-HMF

    (10,311,7)

    pico nao identificado

    (48,1,-48,9)

    pico nao identificado

    (49,0-49,9)

    cumarina

    (38,6-39,4)

    loa

    din

    g (

    PC

    2)

    tempo (min)

    Figura 11- Grfico de loading para os valores da PC2, onde se observa os picos com maiores valores e seus respectivos tempos de reteno.

    Os valores de PC3 so os responsavis pela diferenciao entre os extratos de pequi e

    um segundo grupo formado pelos extratos de canela sassafrz e amendoim e um terceiro

    grupo composto pelos extratos de cabreva-parda e carvalho (Figura 12). Os extratos de pequi

    mostram um perfil nico quando comparado aos demais extratos, mostrando quatro picos

    mais relevantes. Um dos picos eluindo no tempo de reteno de 25,7 minutos, foi atribuido a

    presena p- hidroxibenzaldedo e os dois picos eluindo em 30,70 e 33,1 minutos foram

    respectivamente identificados como vanilina e siringaldedo. O quarto pico com tempo de

    eluio de 36.3 minutos no foi identificado at o presente momento. Ainda com respeito aos

    valores de PC3, o cido elgico e um pico ainda no identificado eluindo em 53,8-55,3

    minutos foram os responsveis pela discriminao entre amostras de cabreva-parda e a

    amostras de carvalho.

  • Resultados e discusso

    37

    10 20 30 40 50 60

    -0.20

    -0.15

    -0.10

    -0.05

    0.00

    0.05

    0.10

    0.15

    loa

    din

    g

    tempo (min)

    cumarina

    (38,6-39,4)

    acido elagico

    (52,1-53,8)

    vanilina

    (30,7-31,2)

    Figura 12- Grfico de loading para os valores da PC3, onde observa-se os picos com maiores valores e seus respectivos tempo de reteno.

    O uso de fingerprint cromatogrfico atualmente recomendado por autoridades como

    WHO (world health organization), FDA (Food and Drug Administration) e EMEA (European

    Medicine Agency) como uma ferramenta para reconhecimento de padres e controle de

    qualidade de sistemas multicomponentes. A aplicao desta tcnica nas amostras dos extratos

    etanlicos de madeiras mostrou-se a primeira vista muito promissora para identificao da

    especie de madeira utilizada no processo de envelhecimento de destilados. A associao do

    perfl cromatogrfico com a nalise multivariada mostrou-se importante para diferenciar os

    extratos etanlicos de madeiras e discriminar os picos cromatogrficos mais relevantes atravs

    dos grficos de PCA. Do ponto de vista fornse o uso do fingerprint pode auxiliar

    decisivamente na busca de biomarcadores de especes e certamente poder ser extendido para

    identificao de madeiras em um ambito bem maior do abordado at aqui.

  • Resultados e discusso

    38

    4.2. Identificao cromatogrfica

    Conforme abordado no item anterior deu-se sequncia a identificao e a quantificao de

    compostos fenlicos e cumricos num contexto confimativo utilizando cromatografia de fase

    liquda acoplada a um detector de massas de multiplo estagios (HPLC-ESI-MSn). Casos onde

    foi observada a coeluio de compotos de interesses como o caso do cido glico, do

    sinapaldedo, do coniferaldedo e do cido elgico, a anlise dos fragmentos gerados ajudaram

    na confirmao ou no dos compostos propostos anteriormente.63 A anlise dos ismeros

    catequina e epicatequina anteriormente realizada via cromatografa de fase lquida acoplada a

    detector de fluorescncia, constitui-se em um exemplo disto.

    A epicatequina foi observada e quantificada atravs do monitoramento dos pico

    cromatogrfico nos comprimentos de onda EM= 280 e EX= 313. A utilizao desta tcnica

    conduziu a atribuio e quantificao equivocada de um pico cromatogrfico eluindo no

    tempo de reteno de 31,1-31,7 minutos como sendo devido a presena da epicatequina. Sua

    confirmao utilizando HPLC-MSn no se verificou. A epicatequina (massa molar= 290,26 )

    quando analisada no modo negativo apresenta alm dos fragmentos do seu pseudo-on

    molecular m/z 289 [M-H]- tambm fragmentos filhos caracterizado pelo fragmento 289

    245 m/z atribuido a perda de (-(CH)2OH) e ao fragmento 289271 m/z atribuido a perda de

    H2O. A observao do perfl dos fragmentogramas mostra a presena de compostos de massa

    molecular elevada, acima de 500 u.m a qual at o presente momento ainda no foi elucidada.

    A presena do isomro catequina por sua vez pode ser confirmada conforme os

    resultados anteriores obtidos por HPLC-DAD-Fluorscencia. A confirmao ocorreu por

    meio da anlise do pico correspondente a catequina eluindo no tR= 26,3-27,1 minutos. Sua

    caracterizao foi realizada baseando-se na anlise dos fragmentos gerados no modo negativo

    e positivo. O modo negativo se mostrou mais sensvel no caso dos compostos fenlicos,

  • Resultados e discusso

    39

    devido a maior facilidade destes compostos perderem um hidrognio64,65 e portanto a

    observao do pseudo-on molecular [M-H]- ser favorecida. A identificao da catequina foi

    realizada pela observao do seu pseudo-on molecular m/z 289 [M-H]- . A presena do

    fragmento m/z 245 (289 (-CH)2OH) da origem a um fragmento muito estvel e de alta

    intensidade. O fragmento m/z 271 (289 (H2O)) refere se a perda de uma molcula de H2O,

    como observado na Figura 13 que reprensenta o fragmentograma gerado no modo negativo

    (condies experimentais ver seo 3, materiais e metodos) que confirmam a identidade da

    catequina.

    Figura 13- Fragmentograma do pico relativo a catequina no modo negativo ESI (-) em uma amostra de extrato de amendoim, nota-se os ons caracteristicos da fragmentao da catequina (m/z: 289, 271 e 245).

    Os fragmentos tanto para catequina como para epicatequina so os mesmo pois ambos

    os compostos so isomeros.66

    Devido a coeluio do sinapaldedo e do coniferaldedo quando se utiliza detector

    espectrofotomtrico, suas presenas no haviam ainda sido elucidadas. O uso de de HPLC-

    MSn permitiu a identificao e a quantificao destes compostos de forma inequvoca. A

    funo cromatograma do ion extraido, adjunta do software Bruker Daltonics Compass 1.1

    289 (H2O)

    Pseudo-on molecular

    289 (-CH)2OH)

  • Resultados e discusso

    40

    for esquire / HCT, possibilitou selecionar a massa do on de interesse agindo como um filtro

    para os demais ons do cromatograma. Isto somado ao conhecimento dos devidos tempos de

    reteno e a adio de padro confirmaram a presena de ambos os compostos.

    O coniferaldedo foi confirmado pela presena do seu pseudo on molecular 177 [M-

    H]- e pelos fragmentos 147 m/z (177147 m/z) atribuido a perda da molcula (-CHCO) e

    162 (177162 m/z) atribuido a perda da molcula de (-CH3). Para o sinapaldeido a presena

    do pseudo on molecular 207 [M-H]- e o fragmento 151 (207151 m/z) atribuido a perda de

    (-CHCO) como tambm a presena do fragmento 166 m/z (207 166 m/z) atribuida a perda

    de (-CH3) confirmam a presena deste aldedo cinmico nas amostras analisadas conforme

    apresentado na Tabela 1.

    Quando se faz uso de tcnicas espectrofotomtricas, a quantificao de cido glico

    pode ser comprometida em cromatografa de fase reversa devido a sua hidrofilicidade. Em

    muitos casos, dependendo do gradiente de eluio, este composto elui muito prximo ao

    tempo morto No presente trabalho, o baixo tempo de reteno (tR= 4,6-5,3 minutos) e a

    possvel presena de compostos coeluindo nesta regio, conforme foi observado nos

    cromatogramas dificultam a sua quantificao (Figura 14). Com o uso de HPLC-ESI-MSn foi

    possvel identificar e quantificar o cido glico sem interferncias dos demais compostos. A

    presena do pseudo on molecular 272 m/z [M-H]- e do fragmento 124 m/z (m/z 272 CO2)

    confirmam a identidade do pico como sendo devido a presena do cido glico.

  • Resultados e discusso

    41

    0 10 20 30 40 50 60 70

    0

    1x106

    2x106

    3x106

    4x106

    mA

    bs

    tempo (minutos

    Figura 14- Amostra de extrato de carvalho exemplificando a dificuldade de se quantificar o cido glico em detector espectrofotmetrico (= 280 nm) no gradiente de eluio empregado (vide seco2).

    O cido elgico, composto relacionado com a hidrlise de elagitaninos em bebidas,

    comum nos extratos de carvalho67, foi facilmente identificado e quantificado via HPLC-DAD

    em quase todas as amostras, exceo das amostras de castanheira. Estas amostras

    apresentavam um pico cromatogrfico correspondente a um composto at o presente

    momento no elucidado, coeluindo com o cido elgico. Atravs do uso de HPLC-MSn e da

    funo cromatograma do on extraido, foi possvel isolar o pico corresponde ao cido

    elgico e quantifica-lo nestas amostras. A Figura 15 ilustra o cromatograma tpico de um

    extrato de castanheira onde se observa a coeluio descrita para o pico do cido elgico. A

    Figura 16 representa o cromatograma do on extrado do cido elgico e a Figura 17 o

    fragmentograma correspondente ao cido elgico.

    Coeluio do cido glico

    cido elgico (52,1-53,8)

  • Resultados e discusso

    42

    A Tabela 2 apresenta os principais fragmentos utilizados para identificao dos

    compostos analisados como tambm seus max e os pesudos-ons moleculares nos modos

    positivo e negativo.

    0 10 20 30 40 50 60 70

    0

    1x106

    2x106

    3x106

    4x106

    mA

    bs

    tempo (minutos)

    Figura 15- Cromatograma do extrato etanlico obtido por gradiente de eluio (vide seo 3) em HPLC-DAD (= 280 nm) de um extrato de castanheira, nota-se a coeluio do pico de cido elgico com o de um composto desconhecido.

    cido elgico (52,1-53,8)

    Composto desconhecido (53,8-54,1)

  • Resultados e discusso

    43

    Figura 16- Cromatograma do on extraido (on selecionado m/z 301, modo negativo) obtido a partir do gradiente de eluio (vide seo 3) analisado por HPLC-ESI(-)-MSn em uma amostra de castanheira.

    Pico do cido elgico extraido a partir da seleo de m/z= 301

  • Resultados e discusso

    44

    Figura 17- Produtos da fragmentao do pseudo-on molecular [M-H]- para o pico extraido referente ao cido elgico operando no modo negativo (ESI(-)).

  • Resultados e discusso

    45

    Tabela 2- Principais fragmentos para os picos identificados, m/z para os pseudos ons-moleculares nos modos negativos (ESI(-)) e positivos (ESI (+), max para cada compostos e as espcies de madeiras onde estes compostos foram identificados.

    Composto max. (nm)

    [ M-H]- (Frag. MS2 m/z) [M +H]+ [M -H]- Madeiras

    Vanilina 290

    151.1 137.1 (-CH3),

    151.1 123 (-CO),

    151.1107 (-CO2)

    153.1 151.1

    Carvalho, cabreva-parda, canela

    sassafraz, pequi, castanheira.

    Eugenol 230

    163.2149 (-CH2),

    163.2137 (-C2H2),

    163.2147 (-CH3),

    165.2 163.2

    Cabreva-parda

    cido glico 272 169.1124.9 (-CO2)

    169.1154.1 (-CH3) 171.1 169.1

    Carvalho, jatob, cabreva-parda, pequi,

    castanheira canela sassfraz

    Escopoletina 345 192 177 (-CH3)

    177 159 (-H2O) 193.3 191.3

    Carvalho, jatob

    Catequina 280

    289.3 245 ( (-CH)2OH)

    289.3271.3 (-H2O)

    289.3179 ( )

    291.3 289.3

    Amendoim, carvalho, cabreva-parda, jatob,

    canela sassafrz

    Mirecetina 256 301151 (RDA) 319.2 317.2 Amendoim, carvalho e

    canela sassfrz

    Cumarina 280

    145 117 (-CO)

    145118

    14590

    147.1 145.1

    Carvalho, cabreva-parda, canela

    sassafraz, pequi, castanheira

    Quercetina 256

    301.2 257 (-CO2)

    301.2179

    301.2127

    301 151 (RDA)

    303.2 301.2

    carvalho

    cido vanlico 260 168124 (-CO2)

    168153 (-CH3) 169.2 167.2

    Carvalho, cabreva-parda, canela

    sassafraz, pequi, castanheira

    Siringaldedo 305

    181 137

    181175

    181 160

    183.1 181.1

    Carvalho, cabreva-parda, canela

    sassafraz, pequi, castanheira

    cido elgico 256

    301.2283 (-H2O)

    301.2257 (-CO2)

    303.2 301.2

    Carvalho, canela sassafraz, pequi,

    castanheira

  • Resultados e discusso

    46

    Tentativas de identificao utilizando o perfil cromatogrfico via HPLC-ESI-MSn de

    todos os picos observados via HPLC-DAD operando em 280 nm foram realizadas, porm sem

    muito sucesso. Em muitos casos alguns picos analisados apresentaram massas elevadas, que

    pode ser indcios de polimerizao de compostos como catequina, que podem ocorrer durante

    o perodo de armazenamento68. Um padro espectral correspondente a dimeros e alguns casos

    at trimeros deste composto foram observado onde massas no valor de m/z 867 e fragmentos

    m/z 578 e m/z 289 podem ser evidencias destas reaes. Este fato esta em estudo neste

    Laboratrio.

    4.3. Fingerprint de Espectrometria de massas por ionizao por eletrospray.

    Os extratos de madeiras foram tambm analisados via insero direta em um espectrometro de

    massas coletando os ons no modo positivo ESI (-) e ESI (+). Os dados obtidos no modo

    negativos deram origem a uma matriz de 25 linhas X 5 colunas sendo as linhas

    correspondentes as amostras e as colunas aos ons selecionados. A seleo de ons teve como

    critrio a sua intensidade nos fragmentogramas. Estabeleceu-se como parametro utilizar

    apenas os ons cuja intensidade fosse superior a 150.000 unidades de contagem. A aplicao

    da anlise de componentes principais ao fragmentograma total via insero deu origem a um

    espectro de massas muito complexo conforme exemplificado na Figura 18.

  • Resultados e discusso

    47

    100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000

    0

    1x104

    2x104

    3x104

    4x104

    5x104

    Inte

    nsid

    ad

    e

    m/z

    fragmentograma de um extrato de carvalho

    Figura 18-Espectro de massas obtido para uma amostra de carvalho via insero direta.

    A soma das duas primeiras PC somam 38% (PC1 28%, e PC2 10%) da explicao da

    variancia dos dados A utilizao dos 5 principais ons, que so apresentados na Tabela 3,

    como descritores mostrou atravs do grfico de scores que a PC1 separou muito bem os

    extratos de carvalho das demais madeiras. A PC1 claramente permitiu separar os extratos de

    carvalho das demais madeiras brasileiras (Figura 19). As amostras de amendoim e de jatob

    tendem a formar um grupo, quando se avalia os valores de PC1 e PC2. As amostras de jatob,

    canela sassafrz e cabreva-parda comportam-se de forma irregular, dispersando-se por todo

    o grfico de PC1 vs PC2.

  • Resultados e discusso

    48

    5,02,50,0-2,5-5,0

    5,0

    2,5

    0,0

    -2,5

    -5,0

    -7,5

    -10,0

    PC1 28%

    PC2 10%

    amendoim

    canela

    carvalho

    jatob

    cabreva

    Classes

    Figura 19- Grfico de scores para a PC1 vs PC2 gerados a partir do fragmentos gerados por ionizao por eletrospray via insero direta dos extratos etanlicos de madeiras.

    O grfico de loading gerados pela anlise de PCA mostra que a presena do fragmento

    m/z 301 foi o principal descritor para as amostras de carvalho. Este fragmento corresponde ao

    pseudo-on molecular do cido elgico ([M-H]-), anteriormente proposto como descritor para

    esta madeira nas anlises via HPLC-DAD e confirmado via HPLC-ESI-MSn. Para as trs

    amostras de amendoim, uma de jatob, uma amostra de cabreva-parda e uma amostra de

    canela sassafrz a presena dos ons m/z 143 e m/z 171 foram os principais descritores, sendo

    responsaveis por estas amostras se agruparem ao lado direito do grfico de scores na Figura

    19. Em trabalho anterior69, utilizando a mesma tcnica aqui descrita, para diferenciao de

    aguardentes envelhecidas em diferentes madeiras, o on de m/z 171 em amostra de jequitib

    foi associado como pertencente ao cido cprico69. A presena do on m/z 143 foi associada

    com a presena de cido caprlico (MM= 144).

  • Resultados e discusso

    49

    Uma amostra de canela sassafrz, uma de cabreva-parda e duas de jatob

    apresentaram um perfil diferente das demais amostras das correspondentes espcies.

    Interessantemente, a amostra de canela sassafrz 1, apresentou como caracteristica que a

    diferenciou das demais, os fragmentos m/z 271, m/z 313 e o fragmento m/z 377. Novamente

    verificou-se em consulta a literatura69 que estes mesmos fragmentos so observados em

    aguardentes armazenadas em amburana e indicam a presena dos compostos narigenina

    (MM=272), pectolinarigenina (MM=314) e de um terceiro um composto no identificado. A

    Tabela 3 apresenta os ons selecionados para analise quimiomtrica.

  • Resultados e discusso

    50

    Tabela 3- Massa dos principais ons selecionados para anlise multivariada. Tipo de

    madeira ons selecionados

    Amendoim 1 143.1 171.1 269 283.1 529.4

    Amendoim 2 143.1 171.1 219 501.4 529.4

    Amendoim 3 171.1 403.3 404.3 501.4 529.4

    Canela

    sassafrz 1 271.1 313.1 377.1 521.2 523.2

    Canela

    sassafrz 2 143.1 171.1 501.4 529.5 613.5

    Carvalho 1 301 339.2 467.1 483.1 487.2

    Carvalho 2 301 323.1 391.1 339.1 513.1

    Carvalho 3 301 483.1 655.4 656.4 817.4

    Carvalho 4 301 323.1 391.1 483.1 517.3

    Carvalho 5 301 323.1 391.1 483.1 497.1

    Carvalho 6 301 323 345 391.1 487.2

    Carvalho 8 301 311.2 325.2 339.2 487.2

    Carvalho 9 301 391.1 467.1 483.1 487.2

    Carvalho 10 301 407.1 483.1 517.3 533.3

    Carvalho 11 301 323.1 483.1 513.1 517.3

    Carvalho 12 301 323.1 483.1 517.3 533.3

    Carvalho 13 301 323.1 339.1 391.1 487.2

    Carvalho 14 301 323 391.1 483.1 517.3

    Jatob 1 143.1 169 171.1 325.2 501.4

    Jatob 2 303.1 317.1 345.1 449.1 621.1

    Jatob 3 273.1 303 431.1 561.2 575.2

    Cabreva 1 233.1 267.2 287.1 303.1 515.3

    Cabreva 2 143.1 171.1 255.2 435.2 477.2

    Em nossos estudos, o uso desta metodologia descrita nesta seco foi abordado de

    forma a fornecer uma comparao com as demais tcnicas utilizadas neste trabalho (Uv-vis e

    fingerprint cromatogrfico). Em linhas gerais, utilizando-se os ons diagnosticos de cada

    madeira tornou-se possvel a separao entre o carvalho e as demais madeiras. Para o

    conjunto de dados inicialmente estudado, dentre as 3 tcnicas utilizadas, a que apresentou os

    menores valores nas explicaes dos dados de varincia foi o mtodo de insero direta no

    espectrometro de massas. Embora metodologia similar tem sido descrita com sucessos em

  • Resultados e discusso

    51

    outro banco de dados69., para o presente banco de dados isto no foi observado. Uma

    possibilidade a ser considerada esta reloacionada com a sensibilidade desta tcnica, onde se

    observa uma padro total de osn presente nas amostras. Isto certamente interessante quando

    se deseja identificar diferenas entre as espcies de um mesmo gnero. Porm, tal fato pode

    no ser to relevante ou mesmo necessrio quando se busca apenas observar padres para

    uma espcie de madeira de forma a caracteriza-la.

    4.4. Analise multivariada aplicada ao espectro eletrnico na regio do UV-vis

    Como ponto de partida foram realizados testes preliminares com um banco de dados

    restrito a 18 amostras, para avaliar a viabilidade de aplicao de nalise multivariada aos

    resultados obtidos por tres tcnicas. Em uma etapa seguinte, o estudo seria extendido a um

    banco de dados maior. O uso do fingerprint cromatogrfico e o fingerprint de massas gerados

    por ionizao por eletrspray j foram anteriormente comentados neste trabalho. Aqui

    aborda-se a utilizao dos valores de absorbncias dos espectros eletrnicos na regio do UV-

    vis. Foram utilizados os espectros coletados de 18 amostras, construindo-se uma matriz de 18

    linhas (amostras) e 90 colunas (absorbncias) e ento aplicada PCA. A soma das duas

    primeras PCs explicam 91% da variao dos dados (PC1 81%.e PC2 10%). Este valor foi

    superior ao observado para os demais modelos at aqui j discutidos. Na anlise da PC1

    observa-se a formao de dois grupos, um situado nos valores positivos da PC1 o quais so

    compostos pelas amostras correspondentes aos extratos de carvalho e jatob, e outro situado

    nos valores negativos da PC1 formados pelos extratos de cabreva-parda e amendoim como

    observado na Figura 20.

  • Resultados e discusso

    52

    Figura 20- Grfico de scores obtido a partir dos valores de absorbncia dos espectro eletronicos na regio do UV-vis (220-400 nm).

    A anlise do grfico de loading indica de forma clara que os comprimentos de onda

    prximos a 280 nm so os principais descritores para os extratos de carvalho e jatob

    enquanto os comprimentos de onda prximos a 230 nm representam os principais descritores

    para as amostras de cabreva-parda e amendoim (Figura 21).

  • Resultados e discusso

    53

    240 260 280 300 320 340 360 380

    -0.3

    -0.2

    -0.1

    0.0

    0.1P

    C 1

    (81%

    )

    nm

    Figura 21- Grfico de loading gerado a partir dos valores de absorbncia para os espectros eletronicos das amostras de madeiras medidas entre 220-400 nm.

    Como comentado anteriormente, os compostos fenlicos em sua maioria apresentam

    banda de absoro mxima prxima a 280 nm. Em resultados anteriores a anlise de fenis

    totais (mtodo de Folin-Ciocalteu) indicou que os extratos de carvalho e jatob foram os que

    apresentaram, dentre os diferentes extratos estudados, os maiores teores de fenis totais. Os

    resultados anteriores63 e os aqui coletados sugerem que o teor de compostos fenlicos

    influncia marcadamente nos espectros eletrnicos e, portanto, na definio dos clusters

    observados. Os baixos teores de vanilina (max = 232 e 309 nm) e a alta concentrao de

    cumarina (max = 280 nm) em extratos de jatob exemplificam esta tendncia49. O mesmo foi

    observado em relao presena de cido elgico (max = 280 nm) nas amostras de carvalho.

    Os extratos de madeiras como a cabreva-parda e o amendoim, que apresentaram

    mximos de absorbncia prximos a 230 nm, exibiram elevados teores dos aldedos

    cinmicos sinapaldedo e coniferaldedo49. Tais aldedos, possuem em seus perfis espectrais

  • Resultados e discusso

    54

    duas bandas com mximos prximos a 240 e 309 nm como observado na Tabela 2. Estes

    compostos provavelmente devem ter influncia na distino desta amostras das demais

    analisadas.

    Analisando os resultados obtidos pelo tratamento quimiomtrico aos dados obtidos

    pelas trs tcnicas utilizadas (fingerprint cromatogrfico, fingerprint do espectro de massas e

    espectro eletrnico) o modelo formulado a partir dos espectros eletrnicos apresentou-se

    como o mais promissor. Considerando-se tambm que o uso de espectrofotmetros de UV-vis

    envolve uma metodologia que tem por virtude caractersticas como simplicidade, baixo custo

    e rapidez, utilizando instrumentao extensamente difundida, robusta e de fcil manuteno,

    optou-se por desenvolver um mtodo de identificao de madeiras com um grupo de amostra

    maior e tambm incluindo outras espcies de madeiras.

    Foram ento preparado 93 extratos de 10 tipos diferentes de madeiras as quais esto

    mencionadas na seco 3.2 , e coletados seus respectivos espectros. A aplicao da anlise de

    componetes principais (PCA), anlise hierarquica de cluster (HCA) e anlise discriminante

    linear (LDA) a estes dados foi ento utilizados para avaliar o potencial de distino e

    classificao dos extratos de madeiras.

    Os espectros de absoro dos extratos de madeiras apresentaram absoro na regio do

    UV e intensidades variveis ao longo faixa de 230-300 nm. Acima de 400 nm a absoro foi

    considerada desprezivel para a anlise em questo. A Figura 22 ilustra alguns espectros

    tipicos de algumas amostras de extratos de madeiras e a Figura 22 as derivadas dos

    respectivos espectros. Para maior clareza, o nmero de espectros desta Figura foi reduzido a

    apenas cinco.

  • Resultados e discusso

    55

    220 240 260 280 300 320 340 360 380 400

    0.0

    0.5

    1.0

    amburana

    balsamo

    carvalho

    amendoim

    jequitiba

    Ab

    so

    rban

    cia

    nm

    Figura 22- Exemplos dos espectros eletrnicos caracteristicos de alguns extratos de madeiras analisados.

    220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420

    -0.05

    -0.04

    -0.03

    -0.02

    -0.01

    0.00

    0.01

    0.02

    Amburana

    balsamo

    carvalho

    amendoim

    jequitiba

    pri

    meir

    a d

    eri

    vad

    a

    nm

    Figura 23- Valores da primeira derivada aplicada aos espectros eletrnicos da Figura 22.

  • Resultados e discusso

    56

    As absores na regio de 250-290 nm indicam a presena de compostos aromticos

    substituidos e de fenilpropanides, tpicos e bem conhecidos da estrutura da lignina70, que so

    exemplificados no Esquema 3, na seco 1. Cabe ainda comentar o fato de que todos os

    extratos foram preparados a partir da mesma cachaa, a qual por si s no apresenta absoro

    substancial nesta faixa de comprimento de onda estudado (inferior a 0,010 A). Esta cachaa

    foi ento utilizada como referncia. Portanto admitiu-se que toda a absoro observada era

    proveniente de compostos extrados da madeira. Os melhores resultados para a anlise da

    PCA foi obtido considerando-se apenas 7 tipos de madeiras. Esta opo foi tomada devido as

    limitaes das interpretaes nos dados gerados, e teve como critrio de excluso a escolha

    das espcies, considerar somente madeiras mais comumente utilizadas em tanoarias ou que

    apresentam interesse em relao a sade do consumidor. Na anlise de PCA para 53 extratos

    de 7 tipos de madeiras (carvalho, amendoim, amburana, blsamo, jatob, jequetib e

    castanheira), os dados obtidos indicam que a somatria das 3 primeiras PC explicam 92% dos

    dados de varincia (PC1 63% + PC2 19 % + PC3 10%).

    O Grfico de scores permitiu observar nitidamente o agrupamento de 6 especies de

    madeiras, a execeo dos extratos de jequitib. As amostras de jequitib no apresentaram um

    perfl homogneo nos valores de scores e se distribuiram ao longo dos eixos da PC1 e PC2

    como obseravado na Figura 24 (PC1 vs PC2) e Figura 25 (PC1 vs PC3).

  • Resultados e discusso

    57

    PC1 63%

    PC2 19%

    0.500.250.00-0.25-0.50

    0.3

    0.2

    0.1

    0.0

    -0.1

    -0.2

    madeiras

    castanheira

    jatoba

    jequitiba

    amburana

    amendoim

    balsamo

    carvalho

    Figura 24- Grfico de scores visualizados na PC1 vs PC2 para os extratos de madeiras obtidos a partir dos espectro eletronicos na faixa de 220-400 nm.

    PC1 63%

    PC3 10%

    0.40.30.20.10.0-0.1-0.2-0.3-0.4

    0.15

    0.10

    0.05

    0.00

    -0.05

    -0.10

    -0.15

    -0.20

    madeiras

    castanheira

    jatoba

    jequitiba

    amburana

    amendoim

    balsamo

    carvalho

    Figura 25- Grfico de scores visualizados na PC1 vs PC3 para os extratos de madeiras obtidos a partir dos espectro eletronicos na faixa de 220-400 nm.

  • Resultados e discusso

    58

    Uma explicao para esta observao pode estar relacionada com o fato de que as

    amostras correspondem a duas espcies do mesmo genro (Cariniana) mas diferente espcies:

    jequitib rosa (Cariniana legalis) e jequitib branco (Cariniana estrellensis).

    Cabe a meno de que em geral nas aguardentes envelhecidas em jequitib no se

    especifica qual espcie utilizada, o que origina produtos com diferentes caractersticas

    sensoriais.

    Quando se faz a anlise do grfico de loading considerando a PC1 e PC2, como na

    Figura 26, observa-se a distribuio dos comprimentos de ondas que caracterizaram os grupos

    observados no grfico de scores na Figura 25. Nota-se ainda que a PC1 responde por 63% da

    explicao dos dados de varincia ou seja, 63 % da explicao dos dados esta distribuido

    nesta direo. Observa-se que os valores positivos da PC1 esto correlacionados com as

    amostras de amburana, blsamo, castanheira e carvalho e os valores negativos da PC1 com as

    amostras de amendoim, de jatob e de jequitib. Numa anlise conjunta dos grficos de

    loading e scores confirma-se que os comprimentos de onda prximos a 280 nm esto melhor

    correlacionados com os extratos de amendoim, jatob e jequitib e os comprimentos e onda

    prximos a 230 descrevem as amostra de amburana, blsamo, castanheira e carvalho,

    conforme comentado anteriormente neste trabalho.

  • Resultados e discusso

    59

    Figura 26- Grfico de loading (PC1 vs PC2) para os dados espectrais dos extratos de madeiras obtidos no intervalo de 220-400 nm.

    Em etapa subsequente os dados de absorbancia tratados por analise de componetes

    principais (PCA) foram explorados por nalise hierarquica de cluster (HCA). Utilizando-se

    toda a faixa espectral de 220-300 nm, os resultados comportaram-se similares aos observados

    na anlise de PCA com excesso das referentes amostras de jequitib.

    Para esta espcie, a qual na PCA apresenta-se de forma espalhada nos grficos de

    scores da Figura 25, um agrupamento foi observado no dendrograma de similaridade na

    anlise de HCA. As amostras de jequitiib tendem a formar um cluster juntamente com

    amostras de amendoim considerando o nvel de similaridade de 66%. Tal fato interessente,

    pois aparentemente a anlise hierarquica de cluster (HCA) mostra um maior poder de

    minimizar as diferenas entre as duas espcies de jequitib, e maximizar a diferena das

    demais famlia, a exceo das amostras de extratos de amendoim. Por outro lado, a anlise de

  • Resultados e discusso

    60

    componetes principais (PCA) mostrou-se como mais eficz a ponto de diferenciar a espcie

    dentro de um mesmo gnero.

    De forma anloga ao observado na Figura 25, as amostra de carvalho e blsamo,

    tambm se agrupam prximas na anlise de cluster (Figura 27), originando dois grandes

    clusters no nvel de similaridade de 20%.

    Os melhores resultados de agrupamento foram observados para as madeiras jatob,

    amburana e castanheira como se observa na Figura 26.

    Figura 27- Dendrograma obtido a partir da anlise hierarquica de cluster para os extratos de sete tipo de madeiras (carvalho, amendoim, amburana, blsamo, jatob, jequetib e castanheira).

    Com os resultados positivos observados nas anlises de PCA e HCA, os quais

    caracterizam um modelo de anlise exploratria, os resultados anliticos foram utilizados na

    elaborao de um modelo classificatrio, utilizando a tcnica de anlise discriminante linear

    0,0

    33,330

    66,67

    100,0 Balsa

  • Resultados e discusso

    61

    (LDA). Duas matrizes foram construidas e anlisadas a partir dos valores de absorbncia

    coletados entre = 220-300 nm.

    Os descritores considerados na anlise discriminante linear foram os valores de

    aborbncia que apresentaram os maiores valores de loading na anlise exploratria de PCA.

    Na aplicao de LDA para os extratos optou-se sempre pela anlise de uma amostra

    especifica em confronto com as demais (e.g. carvalho vs demais madeiras; amendoim vs

    demais madeiras). Portanto para cada modelo foi gerado uma equao linear na forma de y=

    a1x1 + a2x2 + + anxn.

    Na primeira abordagem utilizando somente os extratos de madeiras, foi montado um

    modelo de calibrao formado por 67 amostras de extratos. Boa classificao foi obsevada

    para os extratos testados, principalmente para os extratos de castanheira (100% de acerto) e

    amburana (98% de acertos) como visto na Tabela 4. Aps a criao do modelo de calibrao

    foi-se testado conjunto de 26 amostras que foram utilizadas para o modelo de validao.

    Novamente as melhores porcentagens de acertos foram observados para os extratos de

    castanheira (99%) e amburana (98%). Em geral os modelos de validao apresentam

    porcentagem de acerto inferior frente a porcentagem de acerto de calibrao (Tabela 4). Isto

    atribuido ao fato de que o mtodo de validao cruzada ser mais robusto devido a forma que

    se testa cada amostra do grupo de validao.60,61

  • Resultados e discusso

    62

    Tabela 4 Resultados obtidos para a classificao dos extratos de madeiras para os modelos de calibrao e validao (validao cruzada).

    Madeira Nmero

    total de

    extratos

    Modelo de

    calibrao.

    Nmero de

    amostras

    Modelo de

    calibrao

    Classificao

    correta

    Modelo

    validao

    Nmero de

    amostras

    Modelo de

    validao

    Classificao

    correta

    Carvalho 13 10 95% 3 84%

    Amendoim 8 6 82% 2 80%

    Amburana 10 8 98% 2 98%

    Blsamo 12 9 91% 3 87%

    Jatob 9 7 89% 2 89%

    Cabreva-

    parda

    8 6 78% 2 79%

    Castanheira 12 10 100% 2 99%

    Jequitib 11 9 84% 2 81%

    Canela

    sassafrz

    5 3 82% 1 91%

    Louro

    canela

    5 3 73% 1 74%

    Como uma extenso da aplicao do modelo de classificao proveniente da aplicao

    da LDA, foi testada sua capacidade de classificao utilzando-se agora cachaas comerciais

    envelhecidas em diferentes tipos de madeiras (ver apndice 1). Para tanto se montou um

    modelo de calibrao formado somente pelos extratos de madeiras (93 amostras) e um modelo

    de validao formado por cachaas (50 cachaas) foi estabelecido. O modelo de calibrao foi

    formado por cachaas envelhecidas em funo do tipo de madeira ficou assim distribuido: 9

    cachaas de carvalho, 6 cachaas de amburana, 6 cachaas de amendoim, 10 cachaas de

    balsmo, 2 cachaas de cabreva-parda, 3 cachaas de canela-sassafrz, 5 cachaas de

    castanheira, 7 cachaas de jequitib, 1 cachaa de louro-canela, 1 cachaa de jatob.

  • Resultados e discusso

    63

    Bons resultados observados nos acerto das cachaas comerciais envelhecidas foram

    observados (Tabela 5).

    Excelentes resultados foram observados paras as cahcaas envelhecidas em tonis de

    blsamo, cabreva-parda, canela-sassafrz e jequitib, atingindo 100% de classificao

    correta. Cabe ainda aqui uma observao de que as cachaas envelhecidas em tonis de jatob

    e de louro-canela tambm aparecem na Tabela 5 com 100% de acerto, mas o resultado

    somente ilustrativo, pois uma amostra somente no pode ser considerada estatisticamente

    representativa.

    Tabela 5- validao-cruzada para classificao de cachaas comerciais envelhecidas em diferentes tipos de madeiras.

    Cachaa envelhecida

    (tipo de madeira)

    Nmero de cachaas testadas

    Classificao correta

    Carvalho 9 88%

    Amendoim 6 80%

    Amburana 6 83%

    Blsamo 10 100%

    Jatob 1 100%

    Cabreva-parda 2 100%

    Castanheira 5 80%

    Jequitib 7 100%

    Canela sassafrz 3 100%

    Louro canela 1 100%

    Os resultados obtidos na classificao das cachaas envelhecidas em tonis de

    castanheira e de amburana, no repetiram o mesmo desempenho observado no modelo

    contendo somente extratos. Fatores como tempo de envelhecimento, uso de tonis para

    descanso da aguardente, histrico dos tonis no foram abordados nestas anlises e

  • Resultados e discusso

    64

    provavelmente devem auxiliar a melhor explicar a divergencia destes resultados. Estes itens

    so objetos de estudo em nosso Laboratrio.

  • Consideraes Finais

    65

    5. CONSIDERAES FINAIS E

    CONCLUSO

  • Consideraes Finais

    66

    5. CONSIDERAES FINAIS E CONCLUSO

    Trs tcnicas foram utilizadas neste trabalho com a finalidade de identificar extratos

    de madeira. A identificao de compostos fenlicos utilizando cromatografa de fase lquida

    hifenada a detectores espectrofotomtricos, embora bem estabelecida, carece de cuidados e

    ateno quanto identificao de compostos fenlicos em matrizes complexas. A grande

    variedade de molculas que apresentam absoro de luz em regies semelhantes do espectro

    UV-vis, a eventual presena de ismeros e a baixa resoluo do cromatograma em matrizes

    complexas so alguns dos aspectos que podem conduzir a uma identificao equivocada.

    Por exemplo, a ausncia de epicatequina nos extratos de madeiras , sugerida pela

    analise dos cromatogramas utilizando HPLC-DAD-Fluorescncia, s pode ser elucidada

    atravs das anlises realizadas em HPLC-ESI-MSn analisando-se os fragmentos gerados nos

    modos positivo e negativo. A ausncia do trans-resveratrol, do cido serngico e da quercetina

    nestes extratos tambm foram confirmadas utilizando-se esta ultima tcnica. O uso da

    cromatogrfia para fase lquida acoplada a espctrometro de massas tambm foi util para

    solucionar problemas de coeluio observados para compostos como cido glico e elgico.

    A aplicao de anlise discriminante linear a dados espectrais permitiu construir

    modelos que possibilitam classificar os extratos e tambm cachaas comerciais que

    mantiveram contato com tones de madeira. Os resultados para a classificao de cachaas e

    de extratos se verificou com acertos de 80% ( blsamo e amendoim) a 100% (castanheira e

    amburana).

    O uso do fingerprint cromatogrfico, mostrou-se uma importante ferramenta na anlise

    dos extratos. Embora o fingerprint cromatogrfico tenha nos estudos empregando PCA

    resultados inferiores aos obtidos na anlise do espectro eletrnico por esta mesma tcnica

    quimiometrica, esta metodologia mostrou-se importante pois permitiu apontar possiveis

  • Consideraes Finais

    67

    compostos que possam atuar como biomarcadores das espcies de madeiras. Como exemplos

    de possveis discriminadores temos a cumarina para os extratos jatob, o cido elgico para os

    extratos de carvalho e o 5-HMF para os extratos de amendoim. Trata-se de metodologia

    recomendada por organizaes como WHO, FDA e EMEA para o reconhecimento de

    padres. O tempo de anlise e o custo desta, o tratamento quimiomtrico mais laborioso so

    pontos que devem ser considerados quando se deseja utilizar o fingerprint cromatogrfico.

    O emprego do fingerprint do espectro de massas apresenta caracteristicas similares aos

    do fingerprint cromatogrfico como: o custo, a operao, e a experincia profissional so

    fatores importantes quando se opta por uma metodologia. A difuso de instrumentao de alto

    custo apenas em laboratrios bem especficos e em locais de acesso relativamente restritos

    como areas de fronteira, ou em avaliaes in loco como no caso de organizaes

    certificadoras de bebidas demandam metodologias mais simples e acessveis.

    O uso do espectro eletrnico na regio do UV-vis demonstrou ser uma excelente

    ferramenta para aferio da identidade da madeira empregada na confeco de tonis

    utilizados para armazenagem de bebidas. Algumas vantagens como: uso de instrumentaao

    de baixo custo e extremamente difundida, fcil manipulao, rpidez e robustez tornam esta

    metodologia uma opo para auxiliar na certificao da cachaa envelhecida. Embora o

    presente estudo tenha a aguardente como foco, as concluses aqui obtidas podem ser

    extendidas para outros destilados. Outra possvel aplicao seria a anlise de espcies

    vegetais relevantes para o comrcio de madeira e no controle da extrao ilegal de espcies

    controladas.

    Estamos presentemente trabalhando na aplicao dos mtodos ate ento desenvolvidos

    para o estudo de reaes que se processem nos extratos de madeiras em funo do tempo. A

    anlise dos extratos ao longo de seu envelhecimento mesmo quando armazenados em

    recepientes inertes (recipentes de vidro) podem vir apermitir a proposio de marcadores de

  • Consideraes Finais

    68

    envelhecimento. Tais marcadores seriam de grande importncia para o monitoramento do

    tempo de envelhecimento e portanto permitindo uma atribuio mais confivel do perodo de

    guarda.

    .

  • Referncias

    69

    5. REFERNCIAS

  • Referncias

    70

    5. REFERNCIAS

    1. OWENS, B.; DIKTY, MAYTAG, F. The Art of Distilling Whiskey and Other Spirits: An Enthusiast's Guide to the Artisan Distilling of Potent Potables, Massachussets, Quarry Books, 2009, 185 p.

    2. MCGOVERN, P. E. Ancient Wine: The Search for the Origins of Viniculture. United Kingdom, Oxforshire, Princetom University Press, 2003. 400 p.

    3. LEE, M.; PATERSON, A.; PIGGOTT, J. R. Origins of Flavour in Whiskies and a Revised Flavour Wheel: a Review Journal of The Institute of Brewing, v. 107, n 5, p. 287-313, 2001.

    4. FREGONI, M.; Professor Doutor de Viticoltura e Diretor do Istituto di Frutti-Viticoltura, Italia, comunicao pessoal.

    5. NISHIMURA, K.; MATSUYAMA, R. Em: Maturation and Maturation Chemistry; PIGGOTT, J. R. ed.; Longman: London, 1989, cap. 7.

    6. PIGGOTT, J. R.; CORNNER, J. M.; PATERSON, A.; CLYNE, J. Effects on Scotch whisky composition and flavour of maturation in oak casks with varying histories. International Journal of Food Science and Technology , v. 28, p. 303318, 1993.

    7. LIMA, U. A. Aguardente:fabricao em pequenas destilarias. Editora Fealq: Piracicaba, 1999, p. 176.

    8. ALCARDE, A. R.; SOUZA, P. A; BELLUCO, A. E. S. Aspectos da composio fsico-qumica e aceitao sensorial de aguardente de cana-de-acar envelhecida em tonis de diferentes madeiras. Cincia e Tecnologia de Alimentos, v. 30, n. 1, p. 226-232, 2010.

    9. HAGAN, E. C.;JENNER, P. M.; JONES, W. I.; FITZHUCH, O. G.; LONG, E. L.; BROUWER, J. G.;WEBB, W. K. Toxic properties of compounds related to safrole. Toxicology and Applied Pharmacology, v. 7, p. 18-24, 1965.

    10. LOTLIKAR, P. D.; MICHAEL B. WASSERMAN, M. B. Effects of Safrole and Isosafrole Pretreatment on N- and Ring-Hydroxylation of 2-Acetamidofluorene by the Rat and Hamster. Biochemical Journal, n. 129, p. 937-943, 1972.

  • Referncias

    71

    11. DA SILVA, A. A.;NASCIMENTO, E. S. P.;CARDOSO, D. R.;FRANCO, D. W. Coumarins and phenolic fingerprints of oak and Brazilian woods extracted by sugarcane spirit. Journal of Separation Science, n. 32, p. 3681-3691, 2009.

    12. ZACARONI, L. M.;Cardoso, M. G.;SACZK, A. A.;DE MORAES, A. R.;DOS ANJOS, J. P.;Machado, A. M. R.;NELSON, D. L. Determination of Phenolic Compounds and Coumarins in Sugar Cane Spirit Aged in Different Species of Wood, Analytical Letters, v. 44, n. 12, p. 2061-2073, 2011.

    13. DE MELLO, Mirian Marcolan. Desenvolvimento de uma metodologia por espectroscopia de fluorescncia para identificao de cumarina e 7-hidroxicumarina em drgeas e soro sinttico. 2009. 137 f. (Dissertao de mestrado). Universidade Vale do Paraba, So Jos dos Campos, 2009.

    14. KARTE, B. S. A. J.; HOTCHKISS, S. A. M.;CAPEL, M. Comparative in vitro skin absorption and metabolism of coumarin (1,2-Benzopyrone) in humam, rat. Toxicology and Applied Pharmacology, v. 145, n. 1, p 34-42. 1997.

    15. BRASIL, Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria, Resoluo da Diretoria Colegiada - RDC n. 2, de 15 de janeiro de 2007.

    16. LAKE, B. G.. Coumarin metabolism, toxicity and carcinogenicity: Relevance for human risk assessment. Food and Chemical Toxicology, v. 37, n. 4, p. 423453. 1999.

    17. BRASIL, Ministrio da Agricultura Pecuria e Abastecimento; Instruo Normativa n

    13, de 29/6/2005, Dirio Oficial da Unio, 30/06/2005, seo 1, p. 3.

    18. LANG, J. W. Blending for sale and consumption. In: PIGGOTT, J. R. (ed.): Flavour of Distilled Beverages: Origin and Development, Ellis Horwood Ltd, 1983, p. 256263.

    19. CHATONNET, P. Discrimination and control of toasting intensity and quality of oak wood barrels. American Journal of Enology and Viticulture, v. 50, n. 4, p. 479494, 1999.

    20. CONNER, J. M.;PIGGOTT, J. R.;PATERSON, A. Analysis of lignin from oak casks used for the maturation of Scotch whisky. Journal of the Science of Food and Agriculture, v. 60, p. 349353, 1993.

  • Referncias

    72

    21. GALINARO, C. A.;FRANCO, D. W. Hidrocarbonetos policclicos aromticos (HPAs) em cachaa, rum, usque e lcool combustvel. Qumica Nova, So Paulo, v. 32, n. 6, p. 1447-1451, 2009.

    22. CAMPOS, J. O. S.;AQUINO, F. W. B.;NASCIMENTO, R. F.;COSTA, J. G. M.;KEUKELEIRE, D.;CASIMIRO, A. R. S. Influence and effect of thermal treatment in elaboration of regional wood extracts for cachaa. Journal of Food Composition and Analysis, v. 17, p. 179185, 2004.

    23. CHATONNET, P. ;DUBOURDIEU, D. Identification of substances responsible for the sawdust aroma in oak wood. Journal of the Science of Food and Agriculture , n.76, p.179188, 1998.

    24. CONNER, J. M.;PATERSON, A.;PIGGOTT, J. R. Changes in wood extractives from oak cask staves through maturation of Scotch malt whisky. Journal of the Science of Food and Agriculture , n. 62, p. 169174, 1995.

    25. DIAS, S. M. B. C.;MAIA, A.;NELSON, D. L. Efeito de diferentes madeiras sobre a composio da aguardente de cana envelhecida. Cincia e Tecnologia de Alimentos, v. 18, n. 3, 331334, 1998.

    26. DE MIRANDA, M. B.; MARTINS, N. G. S.; BELLUCO, A. E. S.;HORIIL, J.; ALCARDE, A. R. Perfil fsico-qumico de aguardente durante envelhecimento em tonis de carvalho.Cincia e Tecnologia de Alimentos, Campinas, n. 28, p. 84-89, 2008.

    27. PARAZZI, C.;ARTHUR, C. M.;LOPES, J. J. C.;BORGES, M. T. M. R. Avaliao e caracterizao dos principais compostos qumicos da aguardente de cana-de-acar envelhecida em tonis de carvalho (Quercus. sp.). Cincia e Tecnologia de Alimentos, v. 28, n. 1, p. 193-199, 2008.

    28. LEE, M.; PATERSON, A.;PIGGOTT, J. R..Origins of Flavour in Whiskies and a Revised Flavour Wheel: a Review. Journal of The Institute of Brewing, v.107, n. 5, 2001.

    29. CHATONNET, P.;DUBOURDIEU, D. Identification of substances responsible for the sawdust aroma in oak wood. Journal of the Science of Food and Agriculture, v. 76, n. 2, p. 179188, 1998.

  • Referncias

    73

    30. DE SOUSA, I. C. R. B.; BELCHIOR, A. P.; CLMACO, M. C.. A sensory and chemical approach to the aroma of wooden aged lourinh wine brandy, Cincia e Tcnica Vitivincola, v. 23, n. 2, p. 97-110, 2008.

    31. STONE, H.; SIDEL, J..Sensory evaluation practices. New York: Academic Press, 1993. 2ed., 338p.

    32. ODELLO, L.; BRACESCHI, G. P.; SEIXAS, F. R. F.; DA SILVA, A. A.; GALINARO, C. A.; FRANCO, D. W. Avaliao sensorial de cachaa. Qumica Nova, v. 32, n. 7, p. 1839-1844, 2009.

    33. CALDEIRA, I.; CANAS, S.; COSTA, S.; CARVALHO, E.; BELCHIOR, A. P..1999. Formao de uma cmara de prova organolptica de aguardentes velhas e seleco de descritores sensoriais.Cincia e Tcnica Vitivincola, v. 14, n. 1, p. 21-30, 1999.

    34. CARDELLO, H. M. A. B.;FARIA, J. B..Anlise descritiva quantitativa da aguardente de Cana durante o envelhecimento em tonel de carvalho (Quercus alba L.).Cincia e Tecnologia de Alimentos, v.18, n. 2, 1998.

    35. CARDELLO, H. M. A. B.;FARIA, J. B..Anlise da aceitao de aguardentes de cana por testes afetivos e mapa de preferncia interno. Cincia e Tecnologia de Alimentos, 2000, v.20, n.1, p. 32-36, 2000.

    36. MEILGAARD, M.;CIVILLE, G. V.;CARR, B. T.Sensory Evaluation Techniques, Boca Raton, 3 ed., CRC Press, 1999, 342 p.

    37. Associao Brasileira de Normas Tcnicas; NBR 12994: Anlise sensorial dos alimentos e bebidas, Rio de Janeiro, 1993.

    38. FARIA, J. B.;CARDELLO, H. M. A. B; BOSCOLO, M.; ISIQUE, W. D; ODELLO, L.; FRANCO, D. W. Evaluation of Brazilian woods as an alternative to oak for cachaas aging. European Food Research and Technology, v.218, n. 83, p. 83-87, 2003.

    39. HALUK, J.-P.; IRMOULI, M. The fixed polymer constituents in cooperage oak: cellulose, hemicelluloses and lignin. Journal of Cooperage Sciences and Techniques, v. 4, p. 43-82, 1998.

  • Referncias

    74

    40. MOSEDALE, J. R.; PUECH, J. L. Wood maturation of distilled beverages. Trends in Food Science e Technology, v.9, n.3, p. 95-101, 1998.

    41. GAY, M.; APETREI, C.; NEVARES, I.; DEL ALAMO, M.; ZURRO, J.; PRIETO, N.; DE SAJA, J. A.; MNDEZ, M. L. R. Application of an electronic tongue to study the effect of the use of pieces of wood and micro-oxygenation in the aging of red wine. Electrochimica Acta, v. 55, n. 22, p. 6782-6788, 2010.

    42. CARDOSO, D. R.; SOBRINHO, L. G. A.; NETO, B. S. L.; FRANCO, D. W.. A Rapid and Sensitive Method for Dimethylsulphide Analysis in Brazilian Sugar Cane Sugar Spirits and Other Distilled Beverages. Journal of The Brazilian Chemical Society, v. 15, n. 2, p. 277-281, 2004.

    43. SINGLETON, V. L. Maturation of Wines and Spirits: comparisons, Facts, and Hypotheses. American Journal of Enology and Viticulture, v. 46, n. 1, p. 98-115, 1995.

    44. DOS ANJOS, J. P.; CARDOSO, M. G.; SACZK, A. A.; ZACARONI, L. M.; SANTIAGO, W. D.; DREA, H. S.; MACHADO, A. M. R. Identificao do carbamato de etila durante o armazenamento da cachaa em tonel de carvalho (Quercus sp) e recipiente de vidro. Qumica Nova, v. 34, n. 5, 874-878, 2011.

    45. ANJOS, J. P.; CARDOSO, M. G.; SACZK, A. A.; DREA, H. S.; SANTIAGO, W. D.; MACHADO, A. M. R.; ZACARONI, L. M.; NELSON, D.L.. Evolution of the concentration of phenolic compounds in cachaa during ageing in an oak (Quercus sp.) barrel. Journal of the Brazilian Chemical Society, v. 22, p. 1307-1314, 2011.

    46. PARAZZI, C.; ARTHUR, C. M.; LOPES, J. J. C.; BORGES, M. T. M. R.. Avaliao e caracterizao dos principais compostos qumicos da aguardente de cana-de-acar envelhecida em tonis de carvalho (Quercus sp). Cincia e Tecnologia de Alimentos, v.28, n.1, p. 193-199, 2008.

    47. KAHN, J. H ; SHIPLEY, P. A; LAROE, E. G.; CONNER, H. A. Whisky composition: Identification of additional components by gas chromatography-mass spectrometry. Journal of Food Science, v.34, p. 587-591, 1969.

    48. DA SILVA, A. A. ; NASCIMENTO, E. S. P. ; CARDOSO, D. R. ; FRANCO, D. W. Coumarins and phenolic fingerprints of oak and Brazilian woods extracted by sugarcane spirit. Journal of Separation Science, v.32, p. 3681-3691, 2009.

  • Referncias

    75

    49. REEDER, B.J.; WILSON, M.T. Mechanism of reaction of myoglobin with the lipid hydroperoxide hydroperoxyoctadecadienoic acid, Biochemical Journal, n. 330, p. 13171323, 1998.

    50. BECKER, E. M.; NISSEN, L.R.; SKIBSTED, L.H. Antioxidant evaluation protocols: Food quality or health effects. European Food Research and Technology, v. 19, n. 6, p.561571, 2004.

    51. CARDOSO, D. R.; FREDERIKSEN, A. M.; DA SILVA, A. A.; FRANCO, D. W.; SKIBSTED, L. H.. Sugarcane spirit extracts of oak and Brazilian woods: antioxidant capacity and activity. European Food Research and Technology, v.227, n. 4, p.1109-1116, 2008.

    52. FERREIRA, Rafael Queiroz. Desenvolvimento e aplicao~de um novo ensaio para determinao eletroqumica da atividade antioxidante de compostos modelo e de matrizes complexas. 2009. 155 f. Tese (Doutorado em Fisico-Qumica) Instituto de Quumica de So Carlos, Universidade de So Paulo, So Carlos, 2009.

    53. DE SOUZA, P.; SIEBALD, H. G. L.; AUGUSTI, D. V.; B. NETO, W. B.; AMORIM, V. M.; CATHARINO,R. R.; EBERLIN, M. N.; AUGUSTI, R. Electrospray Ionization Mass Spectrometry Fingerprinting of Brazilian Artisan Cachaca Aged in Different Wood Casks. Journal of Agriculture and Food Chemistry, v. 55, n. 6, p.2094-2102, 2007.

    54. Identificao macroscpica de madeiras, produzido por: Geraldo Jos Zenide, dispinivel em http://www.ebah.com.br/content/ABAAABt68AI/identificao-madeiras-ipt.pdf, acessada em Junho 2011.

    55. FERREIRA, Gracilda. Costa. Modelagem ambiental de espcies de rvores no Vale do Jari, Monte Dourado, Par usando dados do inventrioflorestal. 2009, 204 f. Tese (Doutorado em Botnica) Escola Nacional de Botnica Tropical, Instituto de Pesquisa Jardim Botnico, Rio de Janeiro, 2009.

    56. BRASIL. Ministrio da Agricultura. Portaria n 76 de 26 de novembro de 1986. Dispe sobre os mtodos analticos de bebidas e vinagre. Dirio Oficial da Repblica Federativa do Brasil, Braslia, DF, 28 nov. 1986. Seo 1, pt. 2.

    57. BOSCOLO, M.; ANDRADE SOBRINHO, L. G ; LIMA NETO, B. S.; FERREIRA, M. M. C.; FRANCO, D. W. Spectrophotometric Determination of Caramel Content in Spirits Aged in Oak Casks. Journal of AOAC International, v.85, n. 3, p.744-750, 2002.

  • Referncias

    76

    58. BEEBE, K. R., Pell, R. J., SEASHOLTZ, M. B., Chemometrics, A Practical Guide, A Wiley Interscience publication, New York, USA 1998, 254 p.

    59. ESBENSEN, K. H., Multivariate Data Analysis- In Practice, Alborg University, Esbjerg, Camo Software, 5 ed., 2006. 594 p.

    60. SKOV, T.; VAB DEN BERG; F., TOMASI, G., BRO, R. Automated alignment of chromatographic data. Journal of Chemometrics, v. 20, p. 484497, 2006.

    61. DA SILVA, A. A. Compostos fenlcos em madeiras brasileiras. 2006. 142 f. Dissertao (Mestrado em Ciencias Naturais e da Terra-Qumica Anlitica)- Instituto de Qumica de So Carlos, Universidade de So Paulo, So Carlos, So Paulo, 2006.

    62. RUIZ, D.; EGEA, J.; GIL, I.; TOMS-BARBERN, F. A. Characterization and Quantitation of Phenolic Compounds in New Apricot (Prunus armeniaca L.) Varieties. Journal of Agriculture and Food Chemistry, v. 53, n. 24, p. 9544-9552, 2005.

    63. FANG, N.; YU, S.; PRIOR, R. LC/MS/MS Characterization of Phenolic Constituents in Dried Plums. Journal of Agriculture and Food Chemistry, v. 50, n. 12, p. 3570-3585, 2002.

    64. NIEMEYER, E.D.; BRODBELT, J. S. Isomeric Differentiation of Green Tea Catechins using Gas-Phase Hydrogen/Deuterium Exchange Reactions. Journal of The American Society for Mass Spectrometry, v.18. n.10, p. 1749-1753, 2007.

    65. MAMMELA, P.; SAVOLAINEN, H.; LINDROOS, L.; KANGAS, J.; VARTIAINEN, T. Analysis of oak tannins by liquid chromatography-electrospray ionisation mass spectrometry. Journal of Chromatography A, v. 891, n. 1, p. 75-83, 2000.

    66. ES-SAFI, N.-E.;FULCRAND, H.; CHEYNIER, V.; MOUTOUNE, M. Competition between (+)-catechin and (-)-epicatechin in acetaldehyde- induced polymerization of flavanols. Journal of Agricultural and Food Chemistry. v. 47, n. 5, p. 2088-2095, 1999.

    67. DE SOUZA, P. P. SIEBALD, H. G. L.; AUGUSTI, D.V.; NETO, W. B.; AMORIM, V. M.; CATHARINO, R. R.; EBERLIN, M. N.; AUGUSTI, R. Electrospray ionization mass spectrometry fingerprinting of Brazilian artisan cachaa aged in different wood casks. Journal of Agriculture and Food Chemistry, v. 55, n. 6, p.2094-2102, 2007.

  • Referncias

    77

    68. LUQUE-RODRIGUEZ, J. M.; PREZ-JUAN, P.; D. LUQUE DE CASTRO, M. Extraction of Polyphenols from Vine Shoots of Vitis vinifera by Superheated EthanolWater Mixtures. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 54, n. 23, p. 8775-8781, 2006.

  • Anexo

    78

    ANEXOS

  • Anexo

    79

    ANEXO I

    Campanari (amburana), Maccari (amburana), Maccari (balsamo), Maccari

    (cabreuva),Maccari (jequitib), Maccari (sassafrs), Garrafa 35 ms (carvalho), Garrafa

    8 anos (carvalho), bosco (Amendoim), Obaina (carvalho), Acqua benta (louro/balsamo),

    Canabella (jequitib), Embauba (jequitib), Kullys (amburana), Reserva do capito

    (amendoim), Samanu (carvalho), Engenho Vertente (carvalho), Sirigaita Canrio

    (carvalho), Canelado de Prosa (louro), Verde amarela (jequitib), Ginga Brasil

    (carvalho), Mirahy (carvalho), Dona Carolina (amendoim), Dona Carolina (balsamo),

    Vereda Tropical (balsamo), Aroma Brasil (castanheira), Branquinha de Minas

    (castanheira), Dona Carolina (castanheira), Dona Carolina (amburana), Fazenda

    Jeremias (amburana), Seleta (amburana), 3 Garas (castanheira), Douglas garrafa 2006

    (jequitib rosa), Elisa amendoim 28 2010 (amendoim), So Luiz 61 2010 (amendoim),

    Aroma Brasil (amburana), Campanari (amendoim), Elisa (amendoim), Aroma Brasil

    (balsamo), Ginga (canela sassafrs), B (canela sassafrs), Aroma Brasil (jequitib rosa),

    Velho Ferreira (jequitib), Boazinha (balsamo), Furadinha (balsamo), Pascoal

    (castanheira), Benvinda (jequitib), Campanari (carvalho francs), Campanari (carvalho

    americano), Joo Mendes(carvalho).

    Estas amostras foram obtidas junto a ABRABE (Assoiao Brasileira de

    Bebidas) ou em alguns casos fornecidas gentilmente pelos produtores.

Recommended

View more >